论文部分内容阅读
植物生殖的成功及幼苗的建立是实现种群延续的关键,米槁（Cinnamomum migao H.W.Li）是主要分布于中国西南地区的常绿乔木,因具有极高的药用价值,被誉为贵州省著名的民族苗药。长期以来,自然状态下幼苗幼树缺乏造成了种群世代更替障碍,作为种子植物,其胚胎发育不良、空壳现象严重,且自然与人工条件下种子存在萌发障碍曾被认为是造成种群天然更新差的主要原因,但是否如此,目前还未有涉及相关研究。因此,为更好地探寻和解析米槁种子萌发障碍及天然更新过程的内部限制环节,本文以种子为研究对象,结合形态学、细胞生物学及生理学等方法,对米槁种子形成过程及萌发特性进行系统研究,探寻种子发育及萌发的生理机理,同时利用分子生物学技术,从转录水平系统阐述其萌发的分子机理,并进一步揭示种子萌发复杂的调控机制。主要研究结果如下:1.2018-2019年连续2年对米槁开花物候期观测结果显示,花期为每年2月下旬至4月上旬;米槁为圆锥花序,花朵较小,花冠直径为4.43±0.24 mm;花被片6裂,两面被白色柔毛,长1.15±0.30 mm,宽1.45±0.31 mm;可育雄蕊9枚,均具小柔毛,三轮排列,长0.92±0.02 mm,每个花药具备4个花粉囊;雌蕊长0.61±0.02 mm,子房一室具胚珠1枚;花朵开放时雌蕊与雄蕊间具有一定空间距离,约为0.49±0.05 mm;单花开花时长约4-5天,花粉活力与柱头可授性持续的时间较短,约1-2天。繁育系统测定表明米槁属于兼性异交类型,为自交亲和,有时需要传粉者;经观测,访花传粉者主要包括中华蜜蜂（Apis cerana）、红头丽蝇（Calliphora vicina）、食蚜蝇（Eupeodes corollae）、鼓翅蝇（Sepsis fulgens）、食虫虻（Cophinopoda chinensis）、摇蚊（Procladius nigriventris）、蜉蝣科（Ephemeridea）雌虫、长肩棘缘蝽（Cletus trigonus）。2.米槁种子发育结果显示,果实（种子）最初形成于3月下旬,4-9月为发育期,成熟期集中于10-11月间,持续到12月上旬,成熟时种子空壳率不高;结实存在大小年现象,且影响成熟期时间长短;种子发育与千粒重、贮藏物质（可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白、脂肪含量）、抗氧化酶（SOD、POD及CAT活性）、内源激素（ABA、GA3、IAA、CTK、ETH、BR、JA含量及ABA/GA3、ABA/IAA的比值）呈极显著正相关,与含水量、SA含量呈极显著负相关。3.成熟米槁种子横径、纵径和厚度分别为9.73±0.089 mm、10.73±0.19 mm和9.31±0.20 mm,千粒重为421.34±5.32 g,干种含水率为12.19±1.21%,活力为98.67±1.15%;种胚由子叶、胚芽、胚轴及胚根构成,成熟时形态发育完整,内果皮坚硬,由表皮纤维层、石细胞层和有隔纤维层构成,具透水性;种胚与内果皮均含有萌发抑制物质,不同极性提取液抑制效应表现为内果皮乙酸乙酯相>甲醇相>丙酮相>水相,种胚甲醇相>水相>丙酮相>乙酸乙酯相;采用GC-MS检测技术对内源抑制物成分进行分析,共鉴定出化合物55种,主要为酚类、醛类、脂类、脂肪酸及酮类等抑制物质。4.米槁种子休眠解除结果显示,温度是影响种子萌发最显著的生态因子,10/20℃的变温处理更有利于米槁种子休眠解除;不同化学试剂处理对种子萌发的促进效果表现为H2O2溶液>H2SO4溶液>Na OH溶液;外源激素GA3和IAA预处理能够有效解除胚休眠,GA3溶液浓度为200 mg·L-1时处理效果最佳,比对照组萌发率、萌发势及萌发指数分别显著增加了91.47%,84.14%和113.33%,有效缩短初始萌发天数5天;15℃暖温层积比4℃低温层积更有利于种子休眠解除,GA3预处理能够加速打破种子休眠状态,15℃+200 mg·L-1是种子休眠解除的最佳组合,层积60天后种子萌发率便可达到最大值77.33±4.16%,分别比未层积种子的萌发率、萌发势和萌发指数显著升高了73.11%、89.96%和128.13%。5.层积过程生理变化显示,贮藏物质的动员及酶活性的增加激活了种子内部的生命活动,促进了米槁种子休眠的解除;2种层积处理种子萌发率的提高与可溶性蛋白、POD呈极显著正相关,与淀粉、脂肪含量呈显著负相关;米槁种子萌发4个阶段生理变化显示,种子萌发与贮藏物质可溶性糖、可溶性蛋白含量极显著正相关,与淀粉、脂肪含量极显著负相关;另外,与抗氧化酶MDA、SOD、POD活性极显著正相关;此外,与GA3、IAA、CTK、BR含量呈极显著正相关,与ABA、ETH、JA含量及ABA/GA3、ABA/IAA比值极显著负相关。6.利用Illumina Hi Seq测序技术,对米槁种子萌发4个时期的样品进行转录组分析,在FFS和CCS比较组中,分别获得43,558和40,532个差异表达基因（DEGs）。在CCS比较组中,种子萌发过程中的DEGs主要富集到贮藏物质（脂质、淀粉和蔗糖等）分解、能量供应、抗氧化能力及激素合成等代谢通路,包括甘油酯代谢、淀粉和蔗糖代谢、磷酸戊糖途径、柠檬酸循环（TCA循环）、氧化磷酸化及糖酵解/糖异生等途径中;在种子萌发过程中,LIP、MGLL、ADH及ALDH等三酰甘油分解关键基因,ACSL、ACOX及MPF2等脂肪酸降解关键基因,ISA、AMY、Inv、HK、FK、SS及SPS等淀粉及蔗糖代谢途径中的关键基因在LK及MF阶段显著上调,且脂质降解的相关基因表达量比淀粉及可溶性糖代谢的相关基因提早达到峰值。脂质、淀粉等物质随着种子的萌发逐渐被分解,进入磷酸戊糖途径、糖酵解、TCA循环及氧化磷酸化等供能途径中,在LK阶段,涉及上述途径的关键基因GPI、G6PDH、PGLS及pfp表达量增高了8-10倍,GADPH、pgmⅠ及PK表达倍数上升了9-14倍,MDH、mae B及ALDH表达量增高了8-13倍,ACLY、ACO及CS等表达量增高了6-10倍,加快了LK阶段物质能量的提供;种子抗氧化能力相关的代谢通路,包括过氧化物酶体及苯丙烷生物合成中,68个POD及其他相关基因在LK阶段增强表达,有利于保持种子在萌发过程中的稳态环境。内源激素合成与色氨酸代谢、玉米素生物合成及二萜生物合成等途径相关,在种子LK及MF阶段,ABA分解关键基因CYP707A上调表达11.1倍,GA、IAA及CTK等激素合成的关键基因均显著上调表达。综上所述,米槁花期能够正常完成授粉,但开花物候期较早期研究有所提前;种子在内部生理的协同调节下能够顺利完成生长发育;成熟米槁种子具有内源抑制物及激素水平引起的生理休眠,休眠解除效应结果显示休眠类型为生理浅休眠,可能是引起种子萌发障碍的主要原因;米槁种子休眠解除及萌发过程与内部生理调节密切相关,其中,激素间的平衡对种子休眠的释放及萌发起到了关键作用。