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柑橘是世界第一大水果。我国柑橘栽培面积超过290万公顷,产量达3000万吨,均居世界第一位。随着克里曼丁红橘(Citrus clementina Hort. ex Tan)和甜橙(C. sinensis cv. Valencia)全基因组序列的公布,以及柑橘抗病、抗逆等相关基因序列表达标签(Expressed sequence tags, EST)的大量累积,柑橘基因功能解析已成为目前的研究热点和挑战之一。病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing, VIGS)是近年来发展的一种基因功能研究工具,与转基因、基因敲除、反义抑制等常用生物技术相比,试验周期短,不需要遗传转化,具有操作简便、成本低、高通量等优势。利用VIGS技术有望克服柑橘这种多年生木本作物童期长、遗传转化困难等瓶颈,加速其基因功能研究的进展。为此,本研究在柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus, CTLV)检测方法及多态性研究的基础上,筛选CTLV分离株进行全基因组cDNA扩增、侵染性克隆构建,并进一步开展了在模式植物本生烟(Nicotiana benthamiana)上建立VIGS体系的研究,以期为在柑橘上实施VIGS进而研究其基因功能奠定基础。主要研究结果如下：1. CTLV一步法及巢式RT-PCR检测体系建立通过引物比对,建立了CTLV的一步法及巢式RT-PCR检测体系。其中,一步法RT-PCR产物889bp,包含整个CP及3’UTR序列,比目前的常规RT-PCR操作简便,污染几率小；巢式RT-PCR检测灵敏度高,比一步法RT-PCR至少提高100倍,检测模板总核酸的最低浓度约1.27pg/μL。2. CTLV多态性分析建立了CTLV分子变异的Hinf Ⅰ/RFLP检测体系,定义RFLP组群9个,发现CTLV以单一RFLP组群侵染为主,其中RFLP Ⅰ和RFLP Ⅱ组群可能是优势流行组群,但也存在混合侵染。该体系简便、快速、重复性好,可用于大规模样品的分子变异检测。对收集保存的18份CTLV分离株进行了指示植物鉴定、3’端序列分析及RFLP检测。结果表明,在指示植物腊斯克枳橙(C. sinensis×Poncirus trifoliata cv. Rusk)上表现弱到中等强度症状的6个分离株均属于或携带有RFLP Ⅱ或RFLPⅢ组群,而其它RFLP组群均表现出强毒株特征。在根据3’端序列(889bp)构建的系统进化树上,CTLV分离株聚为了2个同源性组群,同源性组群A包含的8个序列均为RFLP Ⅱ或RFLP Ⅲ组群；同源性组群B则包含了其它RFLP组群的所有序列。同时,在指示植物上表现较弱症状的多数(4/6)CTLV分离物划分在A组群,多数(10/12)CTLV强毒分离物则划分在B组群。可见,指示植物上的弱(中)毒分离株侵染症状-RFLPⅡ或RFLPⅢ组群-同源性A组群三者之间可能存在某种内在联系。RFLP组群检测可用于研究CTLV的分子变异,对于快速鉴定CTLV致病性强弱可能具有参考价值。3. CTLV基因组全长cDNA扩增及序列分析在通过RACE技术获得末端精确序列的基础上,建立了CTLV全长的RT-PCR体系,进而扩增并克隆了CTLV新会橙分离株及满头红分离株基因组全长cDNA。序列分析表明,CTLV-XHC(登录号KC588947)和CTLV-MTH(登录号KC588948)基因组全长均为6497nt[不包括3’poly(A)尾巴],均包含2个开放读码框,在推定的CP及MP上游均具有保守的亚基因组启动子核心序列‘’UUAGGU",与目前已报道的CTLV及苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus, ASGV)的基因组结构一致。同登录GenBank的所有CTLV及ASGV全基因组序列比对显示,CTLV-XHC与我国砂糖橘分离株CTLV-S序列一致性最高,为98%,在依据全基因组核苷酸序列构建的系统进化树上,CTLV-XHC与柑橘来源的CTLV分离株聚为一簇；有趣的是,CTLV-MTH与日本ASGV分离物序列一致性最高,为91%,而与台湾甜橙分离株CTLV-LC一致性最低,为82.0%,在系统进化树上CTLV-MTH与多数ASGV分离株聚为一簇。这一结果对于CTLV与ASGV的起源进化关系具有启示意义。4. CTLV侵染性克隆构建对6个CTLV基因组全长cDNA克隆进行体外转录并摩擦接种昆诺藜(Chenopodium quinoa),症状观察及RT-PCR检测结果表明,CTLV-XHC和CTLV-MTH的体外转录物具有侵染性。为获得适于农杆菌介导接种的CTLV侵染性克隆,以pCAMBIA1301为骨架构建了双元植物表达载体pCSSN:LB-2x35S-MCS-NOS-RB,通过瞬时表达GFP验证其有效性后,采用分步克隆策略将CTLV-XHC和CTLV-MTH分别插入到pCSSN载体2x35S启动子与NOS终止子之间。经筛选、鉴定获得了CTLV侵染性克隆pCSSN-XHC和pCSSN-MTH。农杆菌介导的本生烟(N. benthamiana)注射接种实验表明,二者的侵染症状与野生型病毒对照无明显差异,接种时共表达沉默抑制子p19提高了pCSSN-XHC和pCSSN-MTH的侵染率。5. CTLV诱导的VIGS体系建立以CTLV侵染性克隆pCSSN-XHC为基础,通过重组克隆在CP终止子之后引入NruⅠ识别序列,构建了VIGS载体pCTLV-00:LB-2x35S-XHC(Nru Ⅰ)-NOS-RB。反向插入402bp源于本生烟的八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase, PDS)基因片段后,重组载体pCTLV-PDS402R通过农杆菌浸润接种本生烟,在22℃光照16h和20℃黑暗8h周期条件下,诱导产生了PDS基因沉默的白化表型。Real-time RT-PCR检测结果表明,pCTLV-PDS402R侵染植株PDS基因的相对表达量比空载体pCTLV-00对照下降约25%。说明基于CTLV上的VIGS体系初步建立。为提高VIGS沉默效率,引入具有自我剪切功能的核酶序列到pCTLV-00,构建了VIGS载体pCTLV1:LB-2x35S-XHC(Nru Ⅰ)-RZ-NOS-RB;进一步分别引入135bp、105bp、90bp和61bp的CP亚基因组启动子片段构建了VIGS载体pCTLV2、pCTLV3、 pCTLV4、pCTLV5。上述系列VIGS载体均反向插入了PDS基因片段,基因沉默效应正在评估当中。