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目的:脑卒中,已经成为仅次于缺血性心脏病的第二大死因,也是首要的致残原因。已有研究表明,在小鼠脑缺血/再灌注模型中鉴定出多种环状RNA(circRNA)在病灶区域含量发生变化。其中circHECTD1及circTLK1在病灶区上调,分别通过circHECTD1/miR142/TIPARP 轴及 circTLK1/miR-335-3p/TIPARP 轴,均使得TIPARP(TCDD-inducible poly-ADP-ribose polymerase)蛋白表达量升高[1, 2]。该研究也在星形胶质细胞氧糖剥夺(Oxygen and glucose deprivation, OGD)模型中验证了TIPARP表达升高的现象,并证实抑制TIPARP表达可以降低OGD诱导的星形胶质细胞活化。由于目前对TIPARP在神经系统中功能的研究还十分有限,特别是被其调控的下游基因尚不明了。为了阐明星形胶质细胞对脑卒中损伤的反应及功能恢复的可能机制,本课题初步研究了 TIPARP 相互结合的蛋白和TIPARP引起的转录组表达差异,以期为将来进一步研究TIPARP脑卒中过程中的功能和寻找治疗脑卒中的新靶点提供重要线索。
方法:根据对于TIPARP功能的已有认识,特别是借鉴PARP-1的研究结果,以及星形胶质细胞活化在脑卒中恢复过程中的重要作用,所以假设:TIPARP通过调节星形胶质细胞活化,影响缺血性脑卒中的恢复。本课题利用蛋白质组学和转录组学的技术研究了TIPARP修饰的目标蛋白、相互结合的蛋白和TIPARP诱导的转录本的变化等。我们采用TIPARP高表达慢病毒感染星形胶质细胞模拟脑卒中过程中TIPARP表达增高的现象,利用无标记定量(Label-free)对实验组和对照组进行TIPARP共沉淀的蛋白质进行高通量质谱分析。通过对蛋白质谱测序结果的分析,对和 TIPARP 共沉淀的蛋白进行差异分析、筛选及验证。另一方面,使用相同模型,利用高通量二代测序(NGS)研究TIPARP诱导的转录组的变化。然后运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对转录组高通量测序(RNA-seq)筛选出的差异表达基因进行验证。
结果:本课题着重研究了体外培养的星形胶质细胞中的TIPARP结合的蛋白以及TIPARP诱导的差异基因。通过对与TIPARP结合的蛋白质谱测序结果进行分析,实验共鉴定到的样品间差异蛋白 59 个,筛选了白介素增强子结合因子 2 (Interleukin enhancer-binding factor 2, ILF2)作为候选结合蛋白并进一步进行了结合实验的验证。通过对转录组测序进行分析,最初鉴定到的差异基因为 5252个,进一步选择了12个显著性表达的差异性基因并进行了实时荧光定量PCR验证。
结论:我们的研究筛选并验证了培养的星形胶质细胞中TIPARP结合的蛋白以及TIPARP的诱导基因。进一步的研究表明TIPARP与ILF2之间的没有直接的相互关系,后续需要继续筛选其他的候选蛋白进行验证。通过qRT PCR验证,我们确认了9个与RNA-Seq结果一致的基因,它们有可能参与了TIPARP对星形胶质细胞的的调节过程,可以对这些基因进一步研究,未来有可能成为对研究脑卒中有价值的候选基因。综上,对TIPARP的组学研究,将揭示脑卒中损伤过程中可能的恢复机制,可能为临床治疗提供新的理论依据,药物靶标及干预手段。
方法:根据对于TIPARP功能的已有认识,特别是借鉴PARP-1的研究结果,以及星形胶质细胞活化在脑卒中恢复过程中的重要作用,所以假设:TIPARP通过调节星形胶质细胞活化,影响缺血性脑卒中的恢复。本课题利用蛋白质组学和转录组学的技术研究了TIPARP修饰的目标蛋白、相互结合的蛋白和TIPARP诱导的转录本的变化等。我们采用TIPARP高表达慢病毒感染星形胶质细胞模拟脑卒中过程中TIPARP表达增高的现象,利用无标记定量(Label-free)对实验组和对照组进行TIPARP共沉淀的蛋白质进行高通量质谱分析。通过对蛋白质谱测序结果的分析,对和 TIPARP 共沉淀的蛋白进行差异分析、筛选及验证。另一方面,使用相同模型,利用高通量二代测序(NGS)研究TIPARP诱导的转录组的变化。然后运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对转录组高通量测序(RNA-seq)筛选出的差异表达基因进行验证。
结果:本课题着重研究了体外培养的星形胶质细胞中的TIPARP结合的蛋白以及TIPARP诱导的差异基因。通过对与TIPARP结合的蛋白质谱测序结果进行分析,实验共鉴定到的样品间差异蛋白 59 个,筛选了白介素增强子结合因子 2 (Interleukin enhancer-binding factor 2, ILF2)作为候选结合蛋白并进一步进行了结合实验的验证。通过对转录组测序进行分析,最初鉴定到的差异基因为 5252个,进一步选择了12个显著性表达的差异性基因并进行了实时荧光定量PCR验证。
结论:我们的研究筛选并验证了培养的星形胶质细胞中TIPARP结合的蛋白以及TIPARP的诱导基因。进一步的研究表明TIPARP与ILF2之间的没有直接的相互关系,后续需要继续筛选其他的候选蛋白进行验证。通过qRT PCR验证,我们确认了9个与RNA-Seq结果一致的基因,它们有可能参与了TIPARP对星形胶质细胞的的调节过程,可以对这些基因进一步研究,未来有可能成为对研究脑卒中有价值的候选基因。综上,对TIPARP的组学研究,将揭示脑卒中损伤过程中可能的恢复机制,可能为临床治疗提供新的理论依据,药物靶标及干预手段。