肥胖已成为全球性的公共健康问题,其流行率持续上升,预计下一个10年将增长40%。更另人担忧的是肥胖可引发一系列相关疾病,包括2型糖尿病、心脑血管疾病、高血压、慢性肾脏疾病和非酒精性脂肪肝等,而肥胖相关的胰岛素抵抗是这些疾病起始进程的早期事件。胰岛素抵抗发病机制复杂,可能与内质网应激、炎症、肠道菌群失调相关,但其确切的分子病理机制尚不明确。胰岛素生物学效应的发挥有赖于胰岛素作用的靶细胞内各级信号分子的逐级转导,细胞内信号转导分子的正常表达尤为重要。近年,一类参与转录后基因表达调控的微小RNA(microRNAs,miRNAs)分子备受关注,在许多生物学过程中发挥重要的调控作用。微小RNA通常约由19~22个核苷酸构成,是一类进化上高度保守的单链非编码RNA分子,通过抑制靶基因的翻译,在转录后水平负性调控基因表达。2004年,Poy等首次发现胰岛细胞特异性的miR-375,能够调控胰岛素的分泌,推测其可能参与了2型糖尿病的病理过程,随后,miRNAs作为新的基因表达调控因子,成为研究糖尿病及其并发症分子机制的热点。肝脏作为胰岛素作用的主要靶器官,是葡萄糖代谢的主要场所。那么,肥胖状态下,肝脏组织中的miRNAs是否参与了胰岛素抵抗的发生呢?目前尚不清楚。为此,我们筛选了高脂饮食诱导的胰岛素抵抗状态下小鼠肝脏组织中差异表达的miRNAs;并采用实时荧光定量PCR法鉴定肝脏组织中和软脂酸诱导的胰岛素抵抗AML12肝细胞中差异表达的mi RNAs;生物信息学预测分析差异mi RNAs调控的靶基因及其信号通路,探讨胰岛素抵抗与差异表达的miRNAs的相关性。本实验利用前期实验室建立的高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠模型的肝脏组织标本,分别随机抽取正常对照组和胰岛素抵抗组各3个样本,应用小鼠microRNA芯片进行差异表达的miRNAs的筛查。为了验证芯片筛查结果的准确性,建立茎环-逆转录SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,鉴定小鼠肝脏组织中差异表达的miRNAs。进一步,建立软脂酸(palmitic acid,PA)诱导的AML12肝细胞胰岛素抵抗模型。AML12为小鼠正常肝细胞,用PA诱导建立肝细胞胰岛素抵抗模型,实验设为空白对照组、正常对照组和4个胰岛素抵抗实验组,采用24孔细胞培养板,DMEM低糖培养基培养细胞,每组做6个平行孔。空白对照组不含有细胞,只加DMEM低糖培养基,正常对照组不用PA诱导,4个胰岛素抵抗实验组采用不同浓度的PA诱导,以确定PA的最佳诱导浓度。4个实验组分别加入0.25、0.5、0.75、1 mmol/L的PA诱导8h后,加入含有10-9mol/L胰岛素的正常培养液孵育12h。采用CCK8检测细胞增殖率;葡萄糖氧化酶法测定培养基中葡萄糖含量,计算葡萄糖消耗量;经油红O染色普通显微镜下观察细胞内脂质堆积情况。三种方法综合判断胰岛素抵抗细胞模型是否成功建立。然后,同样采用实时荧光定量PCR方法鉴定差异表达的mi RNAs,在细胞水平上验证芯片筛查结果的准确性。应用生物信息学方法,使用Targetscan数据库、miRanda数据库、PITA数据库联合预测肝脏组织细胞中差异表达miRNAs作用的靶基因,并对靶基因分别进行GO分类和KEGG富集分析,以判定差异表达的miRNAs主要影响的生物学功能及信号通路,并利用STRING10.0软件进行蛋白质-蛋白质相互作用分析。MicroRNA基因芯片筛查结果显示,胰岛素抵抗组和正常对照组小鼠肝脏组织中有3种miRNAs的表达差异显著,即miR-1897-3p、miR-690和miR-7a-5p,且均表达下调,说明胰岛素抵抗状态下小鼠肝脏组织中miRNAs表达谱发生改变。小鼠肝脏组织样本实时荧光定量PCR结果显示,与正常对照组相比,胰岛素抵抗组小鼠肝脏组织中miR-1897-3p、miR-690和miR-7a-5p表达均下调2倍以上,差异有统计学意义(P<0.01),与基因芯片结果一致。利用小鼠正常肝脏细胞AML12用PA诱导,成功构建了PA诱导的胰岛素抵抗肝细胞模型。CCK8检测结果表明,PA浓度为1mmol/L时,细胞增殖率较少,活性明显减退,出现细胞损伤。与正常对照组比对,PA浓度为0.5、0.75时,细胞对葡萄糖的利用均减少,胰岛素抵抗组细胞对葡萄糖的消耗率逐渐降低分别为49.91%、31.89%,差异均具有统计学意义(P<0.01)。细胞油红O染色形态观察,正常对照组细胞边缘清晰,见少量橘红色脂滴;PA诱导后细胞内可见橘红色脂滴堆积,且随着PA浓度增大,脂滴颗粒逐渐增大变多。综合分析细胞增殖率、对葡萄糖的消耗量、和油红O染色结果,确定PA浓度为0.75mmol/L是形成AML12细胞胰岛素抵抗模型最适宜的浓度。造模成功后,AML12细胞实时荧光定量PCR结果显示,与正常对照组细胞相比,胰岛素抵抗组细胞miR-1897-3p、miR-690和miR-7a-5p表达均下调2倍以上,差异有统计学意义(P<0.01),与基因芯片结果一致。生物信息学分析结果显示,靶基因预测和GO分析差异表达的3种mi RNAs均可作用于多个靶基因,miR-1897-3p有745个靶基因,miR-690有1425个靶基因,mi R-7a-5p有3114个靶基因;GO分类表明这些靶基因大多数属于分子功能中的蛋白结合类和细胞组分中的膜蛋白类。从生物学过程看,3种差异表达miRNAs的靶基因大多数参与了转录调控。KEGG信号通路分析结果显示,差异表达的miRNAs靶基因富集于多条信号通路。在KEGG信号通路中,有16种靶基因被两种miRNAs调控。进一步分析这16个靶基因的蛋白质互作网络,发现有8个靶基因可与3种以上的蛋白质相互作用;Rac1、Rhoa、Prkcz、Tgfbr2、Itch、Ube2d3和Epha7位于网络的中心节点,移走它们,网络结构将被破坏。综上,高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠肝脏组织miRNAs表达谱发生改变,miR-1897-3p、miR-690和mi R-7a-5p表达下调。PA成功诱导了小鼠正常肝细胞AML12产生胰岛素抵抗,且miR-1897-3p、miR-690和mi R-7a-5p表达同样降低。miR-1897-3p、miRNA-690和miR-7a-5p参与了胰岛素抵抗的发生,其机制可能通过调节靶基因Rac1、Rhoa、Prkcz、Tgfbr2、Itch和Ube2d3的表达,影响了胰岛素信号通路的级联反应。该研究结果丰富了胰岛素抵抗中miRNAs差异表达谱,为进一步研究胰岛素抵抗中miRNAs作用及机制打下基础。