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克罗诺杆菌(原称阪崎肠杆菌)是一种重要的食源性条件致病菌,它可以污染婴幼儿配方食品,进而引起一系列婴幼儿感染事件,对婴幼儿的健康造成严重威胁。克罗诺杆菌污染食品可能与其在食品接触表面形成生物膜有关,生物膜状态下的细菌不易被清除并广泛传播,因此研究克罗诺杆菌的生物膜形成机制对控制生物膜引起的食品生产过程中的交叉污染具有重要意义。此外,食品、环境及临床感染病例中均分离出克罗诺杆菌耐药菌株,耐药菌株的传播及耐药谱的发展给临床抗感染治疗带来巨大挑战,因此加强克罗诺杆菌耐药性监测及耐药机制的探究尤为重要。本论文运用脉冲场凝胶电泳(PFGE)方法对81株克罗诺杆菌食品分离株进行分子分型,筛选24株不同PFGE带型的菌株进行生物膜形成能力分析。采用4℃冷胁迫和4℃冷适应处理菌株,比较其生物膜形成能力、菌株表面特性和生物膜微观结构的差异,采用反转录荧光定量PCR(qRT-PCR)探究gsiB、luxS、glpQ、sdiA和deoB 5种生物膜相关基因表达量的变化规律,运用高通量测序技术对克罗诺杆菌进行全基因组测序及分析,以挖掘与生物膜形成相关的基因。结果表明,81株克罗诺杆菌共形成71个PFGE带型,带型总体较分散。37℃条件下,24株克罗诺杆菌都能够形成生物膜,其中菌株ES183、ES303、ES295、ES305和ES304具有强生物膜形成能力。4℃冷胁迫可促进菌株生物膜的形成,其中菌株ES055、ES114、ES215和ES300差异显著;4℃冷适应对生物膜形成能力几乎没有影响。克罗诺杆菌为电子供体,4℃培养降低菌株的供电子能力。37℃培养条件下,各菌株的表面疏水性存在差异,其中菌株ES017、ES298和ES299的疏水性较大,4℃培养菌株的表面疏水性降低。4℃冷胁迫和4℃冷适应菌株在不锈钢载片表面均有一定量的菌体粘附,菌株ES017、ES055和ES114形成微菌落,菌株ES113仅有少量散落的菌体。相较于37℃阳性对照菌株,4℃冷胁迫菌株的gsiB、luxS、glpQ、sdiA和deoB基因表达量下调;除少数菌株外,4℃冷适应菌株的gsiB、luxS、glpQ和sdiA基因表达量下调,deoB基因表达量上调。克罗诺杆菌全基因组中发现33种调控细菌生物粘附的基因,如chiA、chiA-2、chiA-2、csgA-1、csgB、eae-1、eae-2、elfA、elfA-1、elfA-2、fimA、fimA-1、fimA-2、hifA、mrpA、papH、papH-1、papH-2、sfaH、smfA、mrkD、sfaS-1、sfaS-2、sfaS-3、sfaS-4、sfaS-5、fliD、prn、elfG、ycbV、nlpE、znuA、ydeH。此外,本实验还研究了克罗诺杆菌的耐药性。采用Phoenix?-100全自动微生物鉴定及药敏系统对305株克罗诺杆菌进行包括阿米卡星、庆大霉素、阿莫西林-克拉维酸、哌拉西林-他唑巴坦、氨苄西林-舒巴坦、氨苄西林、哌拉西林、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢他啶、氯霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、亚胺培南、美罗培南、氨曲南、四环素、复方新诺明共19种抗生素的药敏检测。结果表明,305株克罗诺杆菌中对头孢唑啉和四环素耐药的菌株分别为8株和2株;对头孢唑啉和氯霉素中介的菌株分别为79株和8株;其中菌株ES008对四环素耐药且对氯霉素中介,菌株ES024、ES029和ES059对头孢唑啉和氯霉素同时中介;所有菌株对所测试的其余16种抗生素均敏感。在药敏检测的基础上,选取6株头孢唑啉耐药菌株、2株四环素耐药菌株、2株敏感菌株进行全基因组测序和分析。结果发现6种可能与头孢唑啉耐药相关的基因ampC、ompC、ompN、ompF、phoE、tolC,头孢唑啉耐药和敏感菌株的基因序列比对发现,基因ampC、ompC、ompF、phoE和tolC碱基差异较大;2种四环素耐药基因tetR和tetA,共编码14种蛋白TetR、TetG、TetY、Tet41、TetE、Tet39、TetJ、TetH、TetA、TetB、Tet30、Tet31、Tet33、TetZ。