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在脊椎动物中,精子发生是一个高度协调且保守的过程,即从二倍体精原细胞增殖并分化为成熟的精子,具体包括三个步骤:有丝分裂的精原细胞时期、减数分裂的初级或次级精母细胞时期、单倍体精子细胞形成和成熟阶段。众所周知,孕激素通过与核孕激素受体(nuclear progestin receptor,pgr)结合从而控制哺乳动物的排卵、妊娠和育性等多种生理过程。在硬骨鱼类,已有的生理生化实验结果证实,孕激素包括17α,20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one(17α,20β-DP,DHP)和17α,20β,21-trihydroxy-4-pregnen-3-one(17α,20β,21-P)可能参与卵母细胞成熟、排卵、以及精液产生、精子活力、排精、精原细胞的增殖等过程。DHP为鱼类特有的一种孕激素,可能通过结合膜受体mpgr或核受体pgr促进精子成熟和精子排放,表明DHP在精子发生和成熟过程中具有重要作用。然而,迄今为止在鱼类,甚至整个脊椎动物,核受体pgr介导的孕激素信号通路如何调控精子发生和成熟过程仍然是一个悬而未决的科学问题。因此,为进一步阐明DHP/pgr信号通路在硬骨鱼类精子发生和成熟过程中的作用和分子机制,我们以尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)为实验动物,通过CRISPR/Cas9技术敲除孕激素核受体pgr基因并得到纯合突变系,研究了pgr敲除对性腺组织形态、精子特征、激素水平、类固醇基因表达、促性腺激素和育性的影响。本论文的主要研究结果如下:(1)在孵化后75天的对照雄鱼的精巢,组织学检测发现生殖细胞的减数分裂过程已经启动,可见各级生精细胞。但pgr纯合敲除的精巢仅有少量精原细胞,未见其他各级生精细胞,因此性腺内充满着大量体细胞。表明核受体pgr介导的孕激素DHP信号通路在早期精子发生启动过程发挥重要作用,pgr基因缺失导致该过程延迟。然而在孵化后120天,组织学检测发现,pgr纯合敲除的精巢存在各级生精细胞,表明精子发生已经得到一定程度的恢复。(2)在孵化后300天,pgr基因突变后的精巢变得更小更细,性腺体重指数GSI显著降低。组织学检测和各级生精细胞的定量分析发现,pgr基因敲除导致生精小囊呈不规则排列,各级生精细胞包括精原细胞、精母细胞、精子细胞和精子数量均显著减少。免疫组织化学(IHC)结果显示精母细胞标记基因(PCNA和Ph3)阳性信号显著低于对照组。实时荧光定量PCR(Real-time PCR)结果显示精原细胞标记基因oct4、减数分裂标记基因sycp3,精子细胞标记基因prm以及一些细胞周期标记基因cdk1、cyclinB1、cdc25、cyclinB2的表达均显著降低。另外,通过TUNEL染色以及Real-time PCR检测凋亡标记基因bax的表达都发现敲除组的细胞凋亡高于对照组。综上所述,pgr的缺失影响了精子发生和成熟过程。(3)应用计算机辅助精子分析系统检测发现,pgr基因敲除导致精子的数量、精子活力和平均直线运动速度(VSL)显著下降。将野生型雌鱼(XX)分别与pgr敲除雄鱼(pgr-/-XY)和对照组雄鱼(pgr+/+XY)授精后发现,敲除组受精卵的受精率和存活率明显低于对照组。这些结果表明,pgr敲除导致雄鱼的精子发育异常,育性受到一定程度的影响。(4)我们进一步研究了pgr调控精子发生和成熟过程的分子机制。细胞计数结果显示pgr基因敲除导致Leydig细胞数量显著增高。Real-time PCR分析表明,pgr基因突变导致cyp17a1、cyp17a2、cyp11b2和scc、star1、sf1等类固醇激素合成相关基因的表达水平也显著增高。IHC及蛋白印迹实验进一步证明,在pgr-/-XY的精巢中,Cyp17a1、Cyp17a2和Cyp11b2的表达与对照组相比显著升高,表明pgr敲除可能导致Leydig细胞的类固醇生成细胞数量增加,基因表达水平增高,类固醇合成紊乱。进一步研究发现垂体的fshb和性腺的fshr表达显著降低,说明pgr缺失可能通过影响脑垂体促性腺激素fshb和性腺fshr的表达,进而影响精子发生和成熟过程。综上所述,本研究利用基因敲除技术,围绕着pgr基因突变对尼罗罗非鱼精子发生启始、精子发生、精子成熟和雄性育性等过程进行研究,阐明了孕激素通过结合核受体pgr基因,最终影响精子发生和成熟过程的分子机制。