补体(Complement)是一种精巧有效的蛋白水解系统,处于免疫防御一线,可迅速标记并清除病原微生物或有害成分,介导体液免疫和细胞免疫,是机体中重要的免疫调节和效应放大体系,对于动物的免疫防御至关重要。同时,进化研究显示,补体也是一种古老的免疫辅助系统,最早可以追溯到原口动物,但具有功能的补体真正出现只在脊椎动物有颌类之后,因此,作为最原始的有颌类动物,鲨鱼补体成分的研究对于补体系统的进化发育认识具有特殊的意义。课题前期构建的条纹斑竹鲨鱼(Chiloscylliumplagiosum)24h再生肝脏cDNA文库中,鉴定到补体分子C3,C4,C8α,C9及I因子(factorI)的同源序列,暗示了其重要的生理功能。因此,我们通过RACE-PCR技术克隆到了鲨鱼C8αC9及I因子的全长cDNA及C3和C4的部分序列;另一方面,研究上述补体分子的肝脏表达特征,为了解鲨鱼补体与肝脏的相互关系提供参考;以期为全面认识这些古老的补体分子提供依据。具体完成工作如下:1)条纹斑竹鲨C8α(CpC8α)全长cDNA克隆与分析C8α是攻膜复合物中首个穿透靶细胞膜的关键分子,并促进C9的募集和聚合从而形成跨膜孔道,对补体介导的溶细胞效应具有重要意义。通过RACE和巢式PCR技术,从条纹斑竹鲨鱼的肝脏组织中克隆了 C8αcDNA全长(CpC8α,Genbank登录号KC955236)。通过ORF Finder和Scanprosite等软件对编码产物及其理化性质、结构和功能等进行分析预测。结果表明该基因序列编码591个氨基酸残基,理论分子量为66374 Da,与其他物种来源的C8α相当,结构域组成(TSP/LDLRA/MACPF/EGF/TSP)与哺乳动物 C8α一致;CpC8α 与护士鲨、爪蟾、鼠和人C8α高度同源,同源性分别为89%,49%,45%和44%;基于C8α的系统发育分析也证明了进化上的高度保守性;同时,疏水性轮廓分析显示CpC8α与哺乳动物大体相似,鉴于疏水侧链对于C8α跨膜功能的意义,高度保守的结构可能暗示了 CpC8α具有高等动物中C8α类似的功能。组织分布研究显示CpC8α在鲨鱼肝脏中组成型表达,符合其作为补体主要合成器官的特征。2)条纹斑竹鲨C9(CpC9)全长cDNA克隆与分析C9是补体级联反应中的最后一个分子,也是诱导补体溶细胞效应的关键分子,可介导MAC跨膜孔道的最终形成。通过RACE-PCR,从鲨鱼肝脏中克隆了C9 cDNA全长(CpC9,Genbank登录号KC311226),这也是首次发现的源于鲨鱼的C9基因。生物信息学分析显示,该基因中的ORF序列编码594个氨基酸,分子大小与硬骨鱼及哺乳动物来源的C9分子相当。结构预测显示CpC9蛋白具备MACPF家族的典型结构域组成,为其“成孔”功能提供了必要的结构基础,预示了与高等动物C9分子类似的功能。同源分析进一步证实了 CpC9与其他动物中C9的同源性,其中,与高等脊椎动物之间的同源性高于硬骨鱼,这与系统进化的结果一致,但与物种亲缘关系不完全相符,这可能与目前对低等脊椎动物遗传背景的认识不足有关,今后,随着更多原始物种来源的补体成分发现和研究将有助于获得更全面的补体系统进化和功能研究。3)条纹斑竹鲨I因子(CpFI)全长cDNA克隆与分析I因子(FactorI,FI)是一种重要的补体调控因子,可水解C3b和C4b,抑制C3和C5活化酶的产生,从而调控补体的级联激活过程。通过RACE技术,从鲨鱼肝脏cDNA中克隆了补体调控分子I因子基因全长(CpFI,Genbank登录号KF537389),并分析预测了其表达产物的结构和功能。结果表明,CpFI表达产物由671个氨基酸残基组成,分子中含有13个N-连接糖基化位点;具有其他动物中FI分子的类似结构和高度保守的活性位点,为功能的一致性提供了结构基础。此外,CpFI的N端信号肽和FIMAC之间含有由串联重复序列构成的插入部分,这可能体现了低等脊椎动物中FI的分子多态性。另一方面,FI在其它物种中的组织表达显示出明显的物种特异性和器官特异性,而CpFI在条纹斑竹鲨鱼中具有广泛的组织分布,可能从一定程度上反映了补体调控作用的物种特异性。4)条纹斑竹鲨鱼C3(CpC3)和C4(CpC4)的克隆与序列分析补体分子C3,C4和C5的酶解对补体级联活化及其免疫调节功能具有重要作用。这三种分子是一组同源蛋白,在脊椎动物进化早期由共同祖先分化而来。通过RACE-PCR,从条纹斑竹鲨鱼的肝脏中克隆了 C3和C4部分序列(CpC3和CpC4),位于cDNA3’-端。尽管仅有部分序列,结构分析依然显示了高度的保守性,如其中包含了 C3家族蛋白C端典型结构域,并与高等动物C3或C4蛋白具有一定同源性,而这种保守性也为系统发育聚类结果所证实。组织分布研究显示CpC3和CpC4均在鲨鱼肝脏中组成型表达,但相对于C4较低的肝外表达水平,C3广泛分布于其他组织,这可能体现了补体在组织分布上的种类特异性。5)条纹斑竹鲨鱼中补体成分的肝脏表达特征作为合成补体的主要器官,肝脏是维持代谢稳定的核心器官,对生命活动具有重要意义。不仅如此,近年来大量证据表明,补体和肝脏之间存在着复杂的相互作用和联系:肝脏也是补体效应的靶器官,受到补体成分直接或间接的调控。为了解条纹斑竹鲨鱼中上述补体分子与肝脏的相互关系,我们通过鲨鱼肝脏部分切除模型,分别考察了它们在生理和病理状态肝脏中的表达水平。结果显示,CpC3在正常肝脏中表达水平远超过其他补体分子,这可能和鱼类补体的强大功能是对应的;病理状态下,各补体分子在肝损伤后表达水平均迅速增加,但根据这些成分的本底表达水平和变化幅度,C3的变化最为剧烈。上述结果反映了补体成分的肝脏表达特征,可为了解鲨鱼补体与肝脏的相互作用提供参考。