研究背景前列腺癌不仅是泌尿外科最常见的男性恶性肿瘤,也是引起男性肿瘤相关性死亡的第二大杀手。在美国,前列腺癌的发病率已经超过肺癌,成为发病率最高的男性恶性肿瘤。研究显示随着我国国民的生活饮食方式等逐渐西化,我国特别是经济发达地区泌尿外科接诊的前列腺癌患者日趋增多,有可能会成为我国男性肿瘤发病率的第一位,严重威胁我国男性公民的健康。由于早期前列腺癌缺乏明显的症状,因此容易被忽视而错过了最佳的治疗机会。而此时晚期患者大部分已经出现局部或远处转移,能采用的治疗方法包括内分泌治疗、化疗或姑息治疗等。目前临床上首选的是内分泌治疗,对于激素敏感性前列腺癌疗效佳,但是病情最终会发展为去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)。去势抵抗性前列腺癌是指经过初次持续雄激素剥夺治疗(ADT)后疾病依然进展的前列腺癌,应同时具备以下条件：(1)血清睾酮达去势水平(50ng/dl或1.7nmol/L); (2)间隔1周,连续3次PSA上升,较最低值升高50%以上,此时内分泌治疗基本无效。目前研究提示激素依赖性前列腺癌发展为去势抵抗性前列腺癌可能与以下机制相关：(1)前列腺癌干细胞的存在；(2)凋亡相关癌基因和抑癌基因的及通路的异常表达；(3)配体非依赖性雄激素受体活化；(4)雄激素受体超活化；(5)雄激素受体变异。但是到目前为止,具体的机制尚不明确。而且近年来越来越多的研究显示整个转变的过程可能存在其他的机制,特别是“细胞外”的机制。对于细胞来说,前列腺癌从激素依赖性转变为去势抵抗性是一个漫长的转变过程。在这个过程中,促进发生转变的不仅仅是细胞本身,还包括了细胞周围的环境持续刺激。而肿瘤周围的环境又称为肿瘤微环境,是指肿瘤在其发生和发展过程中所处的内环境,它是一个复杂的综合系统,里面包含了肿瘤细胞自身、多潜能基质细胞或间充质干细胞、成纤维细胞、微血管、上皮细胞前体细胞以及各种各样的免疫细胞和分泌的细胞因子。肿瘤微环境不仅可以为肿瘤的生长提供“肥沃的土壤”,而且还可以还对肿瘤的恶变产生巨大的诱导作用,引起肿瘤细胞发生持续性的基因和表型的改变,使其具有生长优势的能力,能够适应环境的改变。目前,已有大量的研究发现肿瘤微环境可以促进各种肿瘤包括前列腺癌的增殖、抑制凋亡、诱导血管形成、抑制免疫系统和逃避免疫检测、激活免疫细胞促进侵袭转移等。在肿瘤微环境的研究中,目前研究的热点是细胞外囊泡。细胞外囊泡是细胞与细胞之间交流除外细胞因子的另一种新方式。它是双层脂质构成的囊泡,直径在30～2000m,内含蛋白、脂质和核酸。研究表明,细胞外囊泡不仅参与正常的生理调节活动,而且参与多种的病理生理过程,包括肿瘤、炎症性疾病、自身免疫和神经退行性病变。其中肿瘤细胞来源的细胞外囊泡与肿瘤的恶变关系密切,参与调节肿瘤细胞生长、侵袭、转移和血管形成。根据生物合成的过程,细胞外囊泡主要分为外泌体和微囊泡两大类。其中由于外泌体在胞质内合成且富含活性蛋白、脂质和核酸而发挥主要作用。已有研究证实,外泌体与前列腺癌的进展密切相关,包括化疗耐药、免疫抑制、增殖、凋亡和血管形成。但是目前尚没有研究报道外泌体是否参与调节前列腺癌从激素依赖性进展为去势抵抗性的过程。本次课题研究,我们首先探讨了肿瘤微环境在前列腺癌细胞出现激素抵抗的过程中发挥的作用,继而从激素非依赖前列腺癌细胞(androgen independent prostate cancer,AIPC)提取了外泌体并加入到激素依赖性前列腺癌细胞(androgen dependent prostate cancer, ADPC)中,通过体外和体内实验观察外泌体对前列腺癌细胞发生激素抵抗的影响,最后使用基因芯片和高效液相色谱／质谱探讨其中的作用机制,为延缓前列腺癌进展为去势抵抗性前列腺癌提供分子基础,并为进一步治疗干预提供新的方向。研究目的1.探讨肿瘤微环境在前列腺癌进展为激素非敏感这个过程中所起的作用。2.验证外泌体是否参与前列腺癌进展为去势抵抗性前列腺癌这个过程。3.探讨外泌体在去势抵抗发生、发展的过程中的作用机制。研究方法1. LNCAP细胞与PC-3细胞共培养可以促进LNCAP细胞出现激素抵抗1)通过Transwell共培养系统,将LNCAP细胞置于上室,PC-3细胞置于下室,两种细胞进行共培养,4周后细胞用于后续的研究分析。2)MTS检测共培养前后LNCAP细胞增殖能力的变化：消化细胞后计数,按每孔1×104个细胞/100μl培养基分种到96孔板中,收集各个时间点的细胞(Oh,24h,48h,72h,96h),加入20μ1 MTS,孵育3小时后,酶标仪读板,MTS检测读取OD490数据。3)平板克隆检测共培养前后LNCAP细胞克隆形成能力的变化：消化细胞后计数,按每孔1000个细胞种到六孔板中。三周后,将六孔板的细胞固定,结晶紫染色。计算克隆数目。4) Western Blot分析共培养前后AR和PSA蛋白表达的情况：提取各组细胞总蛋白,通过蛋白质SDS电泳,转膜和封闭,孵育一抗和二抗,曝光。5)荧光定量RT-PCR分析共培养前后AR基因及其下游基因PSA、CDK1、CDK2和GRBE1的rnRNA水平变化：提取RNA,逆转录成cDNA,将模板、上下游引物、SYBR Green和DEPC水按一定比例混匀后,上机反应。2.PC-3细胞可以通过分泌外泌体促进LNCAP细胞出现激素抵抗1)采用Exoquick外泌体提取试剂盒,提取PC-3细胞和LNCAP细胞外泌体,通过BCA法进行定量,按一定的浓度加入到细胞中进行处理,其余外泌体-80度保存。2) Western Blot鉴定外泌体标记物TSG101,Alix和HSP70：提取各组细胞总蛋白,通过蛋白质SDS电泳,转膜和封闭,孵育一抗和二抗,曝光。3)使用透射电镜观察外泌体的形态：外泌体悬液5 μl滴于孔径2 nm的载样铜网上,滴加2%磷钨酸溶液20μl负染5 min,干燥后电镜下观察外泌体形态。4)MTS检测PC-3外泌体处理前后LNCAP细胞增殖能力的变化：消化细胞后计数,按每孔1×104个细胞/100μl培养基分种到96孔板中,收集各个时间点的细胞(Oh,24h,48h,72h,96h),加入20μl MTS,孵育3小时后,酶标仪读板,MTS检测读取OD490数据。5)平板克隆检测PC-3外泌体处理前后LNCAP细胞克隆形成能力的变化：消化细胞后计数,按每孔1000个细胞种到六孔板中。三周后,将六孔板的细胞固定,结晶紫染色。计算克隆数目。6)流式细胞法检测PC-3外泌体处理前后LNCAP细胞周期的变化：消化细胞计数,PBS重悬,70%冰乙醇固定细胞,4度过夜。第二天离心去除上清液。细胞沉淀加50μl RNA酶,450μl PI染色液,4h内进行上机检测。7) NOD/SCID鼠致瘤实验检测PC-3外泌体处理前后LNCAP细胞成瘤能力的变化：培养细胞,皮下注射,进行生长曲线绘制。8) Western Blot分析PC-3外泌体处理前后AR和PSA蛋白表达的情况：提取各组细胞总蛋白,通过蛋白质SDS电泳,转膜和封闭,孵育一抗和二抗,曝光。9)荧光定量RT-PCR分析PC-3外泌体处理前后AR基因及其下游基因PSA、CDK1、CDK2和GRBE1的mRNA水平变化：提取RNA,逆转录成cDNA,将模板、上下游引物、SYBR Green和DEPC水按一定比例混匀后,上机反应。3.PC-3外泌体促进LNCAP细胞出现激素抵抗的作用机制的探讨及验证1)通过AFFYMETRIX表达谱芯片检测PC-3外泌体处理前后LNCAP细胞中的差异表达基因并通过Gene Ontology (GO)及KEGG pathway分析,探讨外泌体的作用靶点及相关通路。2) Western Blot验证基因芯片筛选出的可能作用靶点HMOX1的蛋白水平：提取各组细胞总蛋白,通过蛋白质SDS电泳,转膜和封闭,孵育一抗和二抗,曝光。3)荧光定量RT-PCR验证基因芯片筛选出的可能作用靶点HMOX1的mRNA水平：提取RNA,逆转录成cDNA,将模板、上下游引物、SYBR Green和DEPC水按一定比例混匀后,上机反应。4)免疫组织化学法检测HMOX1在前列腺癌组织中的表达5)使用hemin和针对HMOX1的靶向siRNA对LNCAP细胞中的HM0X1进行上调和下调,并采用Western Blot和荧光定量PCR进行验证。6)荧光定量RT-PCR验证hemin和针对HMOX1的靶向siRNA对LNCAP细胞中的HMOX1进行上调和下调的效果：提取RNA,逆转录成cDNA,将模板、上下游引物、SYBR Green和DEPC水按一定比例混匀后,上机反应。7) Western Blot验证hemin和针对HMOX1的靶向siRNA对LNCAP细胞中的HMOX1进行上调和下调的效果：提取各组细胞总蛋白,通过蛋白质SDS电泳,转膜和封闭,孵育一抗和二抗,曝光。8)MTS检测HMOX1上调或下调前后LNCAP细胞增殖能力的变化：消化细胞后计数,按每孔1×104个细胞/100μl培养基分种到96孔板中,收集各个时间点的细胞(0h,24h,48h,72h,96h),加入20μl MTS,孵育3小时后,酶标仪读板,MTS检测读取OD490数据。9)平板克隆检测HMOX1上调或下调前后LNCAP细胞克隆形成能力的变化：消化细胞后计数,按每孔1000个细胞种到六孔板中。三周后,将六孔板的细胞固定,结晶紫染色。计算克隆数目。4.探讨PC-3外泌体内诱导激素抵抗出现的作用分子1)通过高效液相色谱／质谱法比对PC-3和LNCAP外泌体差异蛋白并通过Gene Ontology (GO)分析,探讨PC-3外泌体所含的作用分子。研究结果1. LNCAP细胞与PC-3细胞共培养可以促进LNCAP细胞出现激素抵抗1)光镜结果可以观察到,与PC-3细胞共培养后,LNCAP细胞的形态发生明显改变,细胞移动能力变强呈外向迁移,形态呈细梭形,形态变长,胞质明显减少。2)MTS的结果显示,在正常条件下,与PC-3细胞共培养后的LNCAP细胞的增殖能力与正常的LNCAP细胞相比未发生明显改变；而在去势条件下,与PC-3细胞共培养后的LNCAP细胞在第3天到第5天增殖能力明显比正常的LNCAP 细胞高。3)平板克隆的结果显示,无论是正常条件还是在去势条件下,与PC-3细胞共培养后的LNCAP细胞的克隆形成能力都比正常的LNCAP细胞要强。在去势条件下,两组之间的差异更明显。4)荧光定量PCR的结果显示,与PC-3细胞共培养后,LNCAP细胞的AR基因及其下游的CDK1、CDK2和GRBE1的mRNA水平明显下降。另外,与PC-3细胞共培养后,ⅠNCAP细胞对雄激素的敏感性下降。5) Western Blot的结果显示,与PC-3细胞共培养后,LNCAP细胞的AR和PSA的蛋白水平明显下降。2.PC-3细胞可以通过分泌外泌体促进LNCAP细胞出现激素抵抗1)透射电镜结果可以观察到,PC-3细胞外泌体和LNCAP细胞外泌体均具有典型的外泌体的特征,直径在50～100nm。2) Western Blot的结果显示,两种前列腺癌细胞株来源的外泌体均表达exosome表面特异性标记物TSG101, Alix和HSP70,而不表达GAPDH。3)MTS的结果显示,加入PC-3外泌体处理后的LNCAP细胞的增殖能力无论是正常条件还是在去势条件下都比正常的LNCAP细胞明显要强。在去势条件下,两组之间的差异更明显。4)平板克隆的结果显示,无论是正常条件还是在去势条件下,加入PC-3外泌体处理后的LNCAP细胞的克隆形成能力都比正常的LNCAP细胞要强。在去势条件下,两组之间的差异更明显。5)细胞周期的结果显示,无论是正常条件还是在去势条件下,加入PC-3外泌体处理后的LNCAP细胞周期的S期的比例都要都比正常的LNCAP细胞要高。6)体内成瘤实验结果显示,在正常条件下,PC-3外泌体处理后的LNCAP细胞的成瘤能力明显比正常的LNCAP细胞强。特别是在去势条件下,正常的LNCAP细胞不能成瘤,而PC-3外泌体处理后的LNCAP细胞仍然能部分成瘤。7)荧光定量PCR的结果显示,PC-3外泌体处理后,LNCAP细胞的AR基因的mRNA水平明显下降。另外,PC-3外泌体处理后,LNCAP细胞对雄激素的敏感性下降。8) Western Blot的结果显示,与PC-3细胞共培养后,LNCAP细胞的AR和PSA的蛋白水平明显下降。3.PC-3外泌体促进LNCAP细胞出现激素抵抗的作用机制的探讨及验证1)表达谱芯片分析结果提示：经过PC-3外泌体处理的LNCAP细胞和对照的LNCAP细胞相比,差异表达超过1.5倍的基因有72个,其中67个上调,5个下调。2)荧光定量PCR的结果显示,PC-3外泌体处理后,LNCAP细胞的HMOX1基因的mRNA水平明显上升。3) Western Blot的结果显示,PC-3外泌体处理后,LNCAP细胞的HMOX1的蛋白水平明显上升。4)免疫组织化学的结果显示,激素非依赖前列腺癌的染色强度明显要比激素依赖性前列腺升高。5) Western Blot和qRT-PCR结果显示hemin和针对HMOX1的siRNA均分别能有效上调和下调HMOX1的表达。6)MTS的结果显示,上调HMOX1表达后,在雄激素存在的状态下,其增殖能力与正常LNCAP细胞之间无统计学差异。但是在缺乏雄激素的状态,上调IMOX1的表达可以促进LNCAP细胞的增殖。而当IMOX1的表达下调后,在雄激素存在的状态下可发现LNCAP细胞的增殖能力明显受抑制。而在缺乏雄激素的状态下,实验组和对照组的LNCAP细胞几乎都不能发生增殖。7)平板克隆的结果显示,与正常的LNCAP细胞相比,通过Hemin处理的LNCAP细胞的克隆形成能力与正常LNCAP细胞之间无统计学差异。但是缺乏雄激素的状态下,正常的LNCAP细胞几乎不能形成克隆,而上调HMOX1的LNCAP细胞依然可以形成克隆。而当LNCAP细胞的HMOX1的表达受抑制后,与正常的LNCAP细胞相比,克隆形成能力无明显变化。在缺乏雄激素的条件下,三组细胞均不能形成克隆。4.探讨PC-3外泌体内诱导激素抵抗出现的作用分子1)高效液相色谱/质谱结果分析提示,有2815个蛋白存在于PC-3外泌体中,有2810个蛋白存在于LNCAP外泌体中,有2810个蛋白在两组中均存在,有5个蛋白只存在于PC-3外泌体中。其中LNCAP外泌体与PC-3外泌体相比,蛋白质含量差异变化1.5倍以上的蛋白质有1342个,其中上调的有677个,下调的有665个结论1.PC-3细胞与LNCAP细胞进行共培养后,LNCAP细胞在去势条件下的增殖能力和克隆形成能力明显提高。2.PC-3细胞外泌体作用于LNCAP细胞后,LNCAP细胞在去势条件下的增殖能力和克隆形成能力明显提高。3.PC-3外泌体促进LNCAP细胞产生激素抵抗可能是部分通过上调LNCAP细胞的HMOX1的表达起作用的