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目的:1.探讨水飞蓟宾对临床常见感染细菌的体外抑菌活性及抑菌谱。2.探讨水飞蓟宾与临床常用抗菌素的联合作用。3.研究水飞蓟宾的抑菌机制。为开发新型抗菌药物提供科学依据。方法:1.水飞蓟宾的抑菌活性检测(1)采用微量肉汤稀释法测定水飞蓟宾及其同分异构体(异水飞蓟宾、水飞蓟宁、水飞蓟亭)对临床常见感染细菌(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌)标准菌株的最低抑菌浓度(MIC)。平行测定3次,取平均值。(2)采用平板菌落计数法测定不同浓度水飞蓟宾对临床常见感染细菌的标准菌株生长曲线的影响。实验重复3次。(3)采用微量肉汤稀释法测定水飞蓟宾对常见感染细菌临床分离菌株的最低抑菌浓度(MIC)。平行测定3次,取平均值。(4)采用棋盘微量肉汤稀释法进行水飞蓟宾与临床常用抗菌素(革兰阳性菌选用青霉素和红霉素,革兰阴性菌选用庆大霉素和环丙沙星)联合药敏试验,测定在联合用药的情况下,水飞蓟宾对细菌的最低抑菌浓度(MIC)及抗菌素对细菌的最低抑菌浓度(MIC),并计算联合抑菌指数(FIC)。实验重复3次。2.水飞蓟宾的抑菌机制研究(1)水飞蓟宾对表皮葡萄球菌细胞膜完整性的影响:1 MIC和2 MIC水飞蓟宾分别在37℃作用细菌0 h、0.5 h、1 h、2 h、3 h、5 h、7 h和9 h(对照组用无菌水代替水飞蓟宾)后取样,使用考马斯亮兰-分光光度法分别检测各作用时间点细菌培养液中胞外蛋白浓度(平行测3次),绘制蛋白浓度—作用时间曲线,并比较实验组与对照组的差异性。(2)水飞蓟宾对表皮葡萄球菌菌体蛋白代谢的影响:1 MIC和2 MIC水飞蓟宾分别在37℃作用细菌12 h(对照组用无菌水代替水飞蓟宾)后,将各菌悬液稀释到相同浓度(相同OD值),取等体积离心,制备菌体可溶性蛋白,然后进行SDS-PAGE电泳,对凝胶图谱进行拍照分析。重复实验3次。(3)水飞蓟宾对表皮葡萄球菌核酸代谢的影响:1 MIC和2 MIC水飞蓟宾分别在37℃作用细菌6 h、12 h、24 h和48 h(对照组用无菌水代替水飞蓟宾)后取样,将各菌悬液稀释到相同浓度(相同OD值)后,各取等体积的量与DAPI染液反应,然后于荧光分光光度计上分别测定菌体的DNA荧光强度和RNA荧光强度(平行测3次),并采用SPSS 21.0对二者结果进行单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。(4)水飞蓟宾对表皮葡萄球菌DNA拓扑异构酶活性的影响:pBR322 DNA主要以超螺旋形式(FormⅠ)存在,而拓扑异构酶可以将pBR322 DNA超螺旋形式解旋为开环或线性DNA(FormⅡ)。1 MIC和2 MIC水飞蓟宾分别于37℃对细菌DNA拓扑异构酶和pBR322 DNA混合物作用30 min(对照组用DMSO代替水飞蓟宾)后,通过凝胶电泳及凝胶成像系统观察pBR322 DNA存在的形式,获得水飞蓟宾对表皮葡萄球菌DNA拓扑异构酶的影响。实验重复3次。(5)水飞蓟宾对表皮葡萄球菌生物膜的影响:用1 MBIC和2 MBIC水飞蓟宾分别作用于各阶段(6 h、24 h和48 h)的生物膜,于37℃培养过夜。然后,用结晶紫染色法对生物膜进行半定量测定,运用SPSS 21.0对吸光度值进行单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义;最后用激光共聚焦技术直接观察水飞蓟宾对生物膜形态结构的影响。实验均重复3次。结果:1.水飞蓟宾的抑菌活性(1)水飞蓟宾对革兰阳性菌标准菌株的最小抑菌浓度(MIC)范围为50-400μg/mL,其中对表皮葡萄球菌表现出最强的抑菌活性,MIC值为50μg/mL,而该药对革兰阴性菌标准菌株MIC值范围为>400μg/mL;在水飞蓟宾的同分异构体中,异水飞蓟宾对表皮葡萄球菌、屎肠球菌和粪肠球菌标准菌株的MIC均为400μg/mL,其他同分异构体对临床常见感染细菌的标准菌株的MIC值均>400μg/mL。(2)水飞蓟宾对表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌生长曲线有明显的抑制作用,且随着药物浓度的增加,抑制效果越显著,而该药对大肠埃希菌和铜绿假单胞菌的生长曲线没有任何影响。(3)水飞蓟宾对临床分离革兰阳性菌株的MIC值:表皮葡萄球菌为≥100μg/mL,金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和屎肠球菌均为≥400μg/mL;水飞蓟宾对临床分离革兰阴性菌株的MIC值均>400μg/mL。(4)在联合药敏试验中,对于革兰阳性菌,水飞蓟宾与青霉素/红霉素的联合抑菌指数均以0.5<FIC≤1和1<FIC≤2为主,没有FIC≤0.5和FIC>2;对于革兰阴性菌,水飞蓟宾与环丙沙星的联合抑菌指数均以FIC>2为主,1<FIC≤2较少,没有FIC≤0.5和0.5<FIC≤1。水飞蓟宾与庆大霉素的联合抑菌指数均以1<FIC≤2为主,FIC>2较少,没有FIC≤0.5和0.5<FIC≤1。2.水飞蓟宾的抑菌机制(1)在不同作用时间,药物组与对照组的细菌培养上清液中可溶性蛋白浓度都无显著性差异(p>0.05)。(2)与对照组比较,药物组菌体可溶性蛋白电泳图谱条带更细、更浅,甚至缺如。受1 MIC和2 MIC水飞蓟宾作用的细菌,63 kD-75 kD之间以及17 KD以下的条带均消失。(3)与对照组比较,受1 MIC和2 MIC水飞蓟宾作用的细菌DNA荧光强度分别降低16%及21%以上(p<0.05),受1 MIC和2 MIC水飞蓟宾作用的细菌RNA荧光强度分别降低15%及21%以上(p<0.05)。(4)与1 U拓扑异构酶组比较,水飞蓟宾组的缺口或线性DNA(FormⅡ)均减少,超螺旋DNA(FormⅠ)均增多。(5)在1 MBIC和2 MBIC水飞蓟宾作用下,6 h生物膜培养过夜后生物膜量较对照组分别少16.0%和25.0%,差异具有统计学意义(P<0.05);24 h生物膜培养过夜后生物膜量较对照组分别少7.8%和9.0%,差异具有统计学意义(P<0.05);48 h生物膜培养过夜后生物膜量较对照组分别少17.6%和25.9%,差异具有统计学意义(P<0.05)。(6)不同阶段表皮葡萄球菌生物膜在1 MBIC和2 MBIC水飞蓟宾作用下培养过夜后,与对照组相比,结构呈现不同程度稀疏,死菌相比活菌分布更广,死菌数量更多,生物膜厚度变薄。随着用药量的增加,这些变化更显著。结论:1.水飞蓟宾的抑菌活性(1)水飞蓟宾对革兰阳性菌(标准菌株和临床菌株)的抑菌效果优于革兰阴性菌,其中对表皮葡萄球菌标准菌株抑菌效果最好(MIC=50μg/mL);水飞蓟宾的抑菌活性明显高于其同分异构体。(2)在联合药敏试验中,对于革兰阳性菌,水飞蓟宾与青霉素/红霉素的联合作用效应以相加或无关为主,无协同作用或拮抗作用。对于革兰阴性菌,水飞蓟宾与环丙沙星的联合作用效应以拮抗为主,无协同作用或相加作用;水飞蓟宾与庆大霉素的联合作用效应以无关作用为主,少数可产生拮抗作用,无协同作用或相加作用。2.水飞蓟宾的抑菌机制水飞蓟宾可通过抑制表皮葡萄球菌菌体蛋白和核酸的合成、拓扑异构酶的活性、生物膜形成等达到抑菌作用,但其对细菌细胞膜无影响。