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运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)具有特殊的ED代谢途径和较高糖发酵效率,是目前构建纤维素生物质产乙醇及其他生物基平台化合物工程菌的优选宿主之一。为使该菌能产丁二酸,本文开展了丁二酸合成代谢途径构建、代谢及生理生化评估、适应性进化及基因组重测序等研究工作。主要结论如下:(1)基于Z.mobilis ZM4 ED代谢途径分析,通过同源重组方法分别敲除乳酸脱氢酶基因ZMO1237(ldhA)、丙酮酸甲酸裂解酶基因ZMO1570(pfl)、丙酮酸脱羧酶基因ZMO1360(pdc)、乙醇脱氢酶基因ZMO1596(adhB)四个基因,成功构建了4株单基因敲除菌株Z.mobilis ZM1237、ZM1570、ZM1360和ZM1596。(2)生长情况分析表明:野生菌生长优于突变株,但至发酵稳定期,生长基本趋于一致。代谢产物分析表明:在低糖浓度下,工程菌株更利于生成丁二酸,其中菌株ZM1360产丁二酸能力最强,浓度达2.8 g/L,生产强度为0.1 g/L/h。酶活测定结果表明:与野生菌相比,菌株ZM1237的LDH酶活下降19.5%;ZM1360的PDC酶活下降了35.85%;ZM1596的ADH酶活下降了69.51%。定量PCR结果表明:菌株ZM1237 ldhA基因表达下降8.8%;ZM1360 pdc基因表达下降82%,而菌株ZM1596基本无adhB基因表达。综上结果表明通过代谢工程策略对产丁二酸竞争途径阻断,成功构建了可产丁二酸的Z.mobilis工程菌株。(3)为提高Z.mobilis ZM4对纤维素水解液中抑制物的耐受能力,利用适应性进化,通过3轮胁迫条件下筛选,成功获得可耐受7 g/L乙酸的进化菌株Z.mobilis ZMA7-2(保藏号:CGMCC No.9987)和耐受3 g/L呋喃甲醛的进化菌株Z.mobilis ZMF3-3(保藏号:CGMCC No.9986)。生长情况表明:在7 g/L乙酸胁迫下培养至18 h时,ZMA7-2生长密度比野生株增加了2.64倍;而在3 g/L呋喃甲醛胁迫下培养至18 h时,ZMF3-3生长密度比野生株提高了2.24倍。乙醇发酵表明:在7 g/L乙酸胁迫下,ZMA7-2和对照株在产乙醇量方面无明显差异,但进化菌株产乙醇效率明显高于对照株。在3 g/L呋喃甲醛胁迫下,Z.mobilis ZM4几乎不能存活,相比无胁迫情况下,Z.mobilis ZM4乙醇产量下降了89.9%;而胁迫情况下,进化菌株产乙醇能力显著高于对照株,ZMF3-3乙醇产量达理论值的94.84%。RAPD结果表明:在进化菌株中可能存在大量的SNP位点。关键酶活结果表明:呋喃甲醛对PDC和ADH酶活的抑制作用影响比乙酸对菌株酶活影响更大,尤其是对ADH酶活活性。(4)比较基因组重测序表明:ZMA7-2有79个SNP位点,而ZMF3-3有82个SNP位点。其中有71个相同SNP位点,有8个SNP位点为ZMA7-2特有,而ZMF3-3则有11个SNP位点为特异性的。同样地,突变菌株基因组也发生了核酸序列删除和核酸序列插入等结构变异,初步揭示了适应性进化菌株获得性表型的遗传基础。(5)以Z.mobilis ZMA7-2、ZMF3-3为宿主菌株,成功获得2株突变菌株ZMA7-2△pdc和ZMA7-2△adhB。