论文部分内容阅读
研究背景哮喘是由基因和环境因素共同导致的常见呼吸道疾病,其发病机制、治疗等诸多环节仍尚未完全清楚,因此探讨哮喘发病机制、寻找新防治靶点仍然是研究的重要内容。肺组织高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1,HMGB1）是一种高度保守的核蛋白,可作为一种免疫调节因子和炎性因子参与气道炎症;Toll样受体4（Toll like receptors 4,TLR4）是一种重要的免疫识别受体,连接天然免疫和获得性免疫,在启动和调节气道炎症过程中发挥重要作用。HMGB1可与TLR4结合并相互作用,通过激活核转录因子（Nuclear factor-kappa B,NF-KB）,引起下游的炎症介质释放。维生素D既参与钙磷代谢调节,还具有免疫调节作用,主要通过影响单核细胞、树突状细胞（Dendritic cell,DC）、淋巴细胞等免疫细胞发挥广谱的抗炎作用,并通过影响多种细胞的生长和分化参与气道结构的调节。目前,国内外关于维生素D与哮喘的研究有一些报道,但具体作用机制仍不明确。关于HMGB1、TLR-4在哮喘动物肺组织的表达及维生素D的干预研究较少,而哮喘动物外周血和支气管肺泡灌洗液（BALF）中的表达研究更少,HMGB1/TLR4/NF-KB信号通路及维生素D的调控研究国内外未见报道。本课题拟通过建立哮喘小鼠模型,观察肺组织病理学改变,BALF中细胞计数和分类变化,外周血和BALF中HMGB1、TLR-4、IL-4和IFN-γ含量变化;肺组织HMGB1、TLR4和NF-KB m RNA和蛋白的表达变化,进一步探讨哮喘的发病机制。维生素D是一种生物制剂,副作用小,价格便宜,使用依从性好,与类固醇激素作用相似;本实验应用该药进行干预性试验,观察其对HMGB1/TLR4/NF-KB信号通路及气道炎症和气道重塑的影响,从新的角度诠释其在哮喘防治中的作用,进一步挖掘老药的新用途,为临床研究和应用提供基础实验依据。第一部分不同剂量维生素D对哮喘小鼠肺组织HMGB1、TLR4表达的影响目的通过建立哮喘小鼠气道重塑模型,观察HMGB1及TLR4在肺组织的表达,以及不同剂量维生素D对哮喘气道重塑及HMGB1和TLR4表达的影响。方法50只BALB/c小鼠随机分为5组:对照组、哮喘组、1,25-（OH）2D3低剂量组、1,25-（OH）2D3中剂量组和1,25-（OH）2D3高剂量组,每组10只。采用卵清蛋白（OVA）致敏建立哮喘模型,对照组以生理盐水代替,然后给予1,25-（OH）2D3低、中、高三种剂量干预,采用苏木精-伊红（HE）染色在光学显微镜高倍镜视野（10×40）下观察小鼠肺组织病理学变化,支气管壁厚度的测定采用计算机病理图像分析系统进行。采用免疫组化法观察肺组织HMGB1及TLR4表达的变化,应用计算机病理图像分析系统测定蛋白的表达量。采用RT-PCR法检测HMGB1及TLR4m RNA表达变化,基因的相对表达量按灰度值比值公式计算。结果1哮喘组小鼠出现流涕,打喷嚏,呼吸急促,咳嗽,点头呼吸等哮喘样表现,重者出现紫绀,四肢瘫软;提示模型制作成功。2哮喘组小鼠气道损伤明显、可见大量炎性细胞浸润,上皮细胞紊乱、脱落,气道壁明显增厚,管腔狭窄;1,25-（OH）2D3低、中剂量组支气管壁结构较哮喘组完整光滑,管腔狭窄和炎性细胞浸润较哮喘组减轻;但高剂量组较哮喘组气道结构破坏加重。3哮喘组小鼠气道壁厚度较对照组明显增加,1,25-（OH）2D3低、中剂量组气道壁厚度较哮喘组明显减轻（均P<0.05）,但高剂量组小鼠气道壁厚度却较哮喘组明显增加（P<0.05）。4免疫组化结果显示:对照组小鼠HMGB1和TLR4蛋白表达较弱;哮喘组小鼠HMGB1和TLR4表达较强,哮喘组较对照组HMGB1和TLR4表达明显增高（均P<0.05）;1,25-（OH）2D3低、中剂量组HMGB1及TLR4表达明显低于哮喘组（均P<0.05）,而高剂量组则明显高于哮喘组（均P<0.05）。5 RT-PCR结果显示:哮喘组HMGB1m RNA和TLR4 m RNA表达较对照组明显增高;1,25-（OH）2D3低、中剂量组HMGB1 m RNA和TLR4 m RNA相对表达量均较哮喘组明显降低（均P<0.05）,而高剂量组则明显高于哮喘组（均P<0.05）。结论1在OVA致敏的哮喘气道重塑模型中,HMGB1和TLR4表达明显增高;2适量1,25-（OH）2D3可降低肺组织HMGB1和TLR4表达,减轻气道重塑;过量则可能增加HMGB1和TLR4表达,加重气道重塑;3适量1,25-（OH）2D3可能通过抑制HMGB1/TLR4信号通路,阻止下游的炎症因子释放,改善哮喘气道重塑。第二部分哮喘小鼠HMGB1/TLR4/NF-ΚB信号通路及维生素D的作用目的观察不同时间点哮喘小鼠病理学变化,BALF中细胞总数和分类变化,外周血和BALF中HMGB1、TLR4、IL-4和IFN-γ含量变化,肺组织HMGB1、TLR4和NF-KB m RNA和蛋白表达变化,以及维生素D的干预作用。方法48只BALB/c小鼠随机分为3组,对照组、哮喘组和1,25-（OH）2D3干预组,每组小鼠为16只。雾化激发处理后,每组按两个观察时间点（1周和2周）进行标本处理,每个时间点取小鼠标本8只。建立哮喘激发1周和2周动物模型,同期采用中等剂量的1,25-（OH）2D3进行干预试验。各组按不同时间点取小鼠右肺中叶进行HE和免疫组化染色,观察小鼠病理学变化,测定其气道壁厚度,观察HMGB1、TLR4和NF-KB在肺组织的表达部位。同时收集BALF和外周血,BALF进行细胞学检测;采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定BALF和外周血中HMGB1、TLR-4、IL-4和IFN-γ含量;采用实时定量荧光PCR（Real-time PCR）和Western blot（蛋白质印迹法）分别从m RNA和蛋白质水平检测HMGB1、TLR4和NF-KB表达变化,基因的相对表达量按2-△△Ct计算,蛋白的相对表达量根据相对灰度值公式计算。结果1哮喘组1,2周气道壁厚度和气道损伤较对照组1,2周明显增加（均P<0.05）;干预组1,2周较哮喘组1,2周气道壁厚度和气道结构破坏明显减轻（均P<0.05）。2哮喘组1,2周与对照组1,2周比较,BALF中白细胞总数,嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞比例明显升高,单核/巨噬细胞比例明显下降（均P<0.05）;干预组1,2周与哮喘组1,2周比较,BALF中白细胞总数,嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞比例明显下降,单核/巨噬细胞比例明显上升（均P<0.05）。3哮喘组1,2周BALF中HMGB1、TLR4和IL-4含量均明显高于对照组1,2周,IFN-γ含量均明显低于对照组1,2周（均P<0.05）;干预组1,2周BALF中TLR4和IL-4均明显低于哮喘组1,2周,IFN-γ含量均明显高于哮喘组1,2周（均P<0.05）;第1周时干预组BALF中HMGB1较哮喘组无变化（P>0.05）,但第2周时干预组明显低于哮喘组（P<0.05）。4哮喘组1,2周外周血中HMGB1和IL-4含量均明显高于对照组1,2周,IFN-γ含量均明显低于对照组1,2周,干预组1,2周外周血中HMGB1和IL-4均明显低于哮喘组1,2周,IFN-γ含量均明显高于哮喘组1,2周（均P<0.05）;第1周时哮喘组外周血中TLR4含量与对照组比较无差异（P>0.05）,但第2周时明显高于对照组（P<0.05）;第1周时干预组外周血中TLR4含量与哮喘组比较无差异（P>0.05）,但第2周时明显低于哮喘组（P<0.05）。5哮喘组1,2周肺组织中HMGB1、TLR4、和NF-KB m RNA表达量均明显高于对照组1,2周;干预组1,2周肺组织中TLR4和NF-KB m RNA表达量均明显低于哮喘组1,2周（P均<0.05）。第1周时干预组HMGB1 m RNA与哮喘组比较无明显差异（P>0.05）,但在第2周时干预组则明显下降（P<0.05）。6哮喘组1,2周肺组织中HMGB1、TLR4和NF-KB蛋白表达量均明显高于对照组1,2周;干预组1,2周肺组织中HMGB1、TLR4和NF-KB蛋白表达量均明显低于哮喘组1,2周（均P<0.05）。7小鼠气道壁厚度与肺组织HMGB1、TLR4和NF-KB m RNA的表达量均呈正相关性（r分别为0.802,0.895,0.834;均P<0.05）;肺组织HMGB1、TLR4和NF-KB的m RNA表达量及蛋白表达量间均呈正相关（r分别为0.871,0.841,0.823;均P<0.05）。8外周血中IL-4、IFN-γ与BALF中IL-4和IFN-γ浓度均呈正相关（r分别为0.600,0.743;均P<0.05）;外周血和BALF中IL-4浓度与HMGB1、TLR4浓度间均呈正相关性（r1分别为0.696,0.331,r2分别为0.695,0.648;均P<0.05）。9 BALF中HMGB1、TLR4含量分别与肺组织中HMGB1m RNA、TLR4m RNA,外周血HMGB1、TLR4含量分别与肺组织中HMGB1m RNA、TLR4m RNA间均呈正相关（r1分别为0.756,0.762,r2分别为0.762,0.327;均P<0.05）;HMGB1和TLR4含量在BALF和外周血间均呈正相关（r1为0.617,r2为0.325;均P<0.05）。10 BALF中HMGB1和TLR4含量分别与细胞总数、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞比例均呈正相关（r1分别为0.796,0.787,0.754,0.749;r2分别为0.730,0.698,0.558,0.480,均P<0.05）。结论1哮喘小鼠气道重塑早期,肺组织高表达HMGB1、TLR4和NF-KB;2 HMGB1和TLR4与气道炎症和免疫紊乱有关;适量1,25-（OH）2D3可减轻气道炎症,可能与调节Th1/Th2细胞平衡有关;3哮喘小鼠外周血和支气管肺泡灌洗液中均高表达HMGB1和TLR4蛋白,适量1,25-（OH）2D3可以下调两者的表达;4哮喘小鼠肺组织同时高表达HMGB1、TLR4和NF-KB的m RNA和蛋白,三者与气道重塑相关,适量1,25-（OH）2D3可以下调三者的表达,改善气道重塑;5 HMGB1/TLR4/NF-KB信号通路在哮喘发病中起重要作用,适量1,25-（OH）2D3可能通过对其的调控作用阻止哮喘的进展,有望成为哮喘治疗的新选择。