间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一类能够自我更新，具有多向分化潜能，最早从骨髓分离的成体干细胞。它能够向脂肪、成骨和软骨细胞分化，也可以跨胚层分化，是组织工程的一个理想种子细胞。大量的研究报道称，MSCs能够用于心肌组织，损伤的骨组织、软骨组织和肌腱的修复和再生。　　 MSCs具有低免疫原性，能够提供细胞因子和生长因子支持造血干细胞的扩增和成熟。另外，它能够与免疫系统相互作用，具有免疫抑制作用。将体外培养的MSCs输入体内后，可诱导外周免疫耐受，并且可迁移到受损组织，降低促炎症因子的表达，促进受损细胞的存活。令人关注的是，体内研究发现，MSCs能够促进异体皮肤移植的存活，降低了移植物抗宿主疾病(GVHD)的发病率和疾病进程。　　 本研究应用胶原酶消化骨片的方法成功分离小鼠MSCs，并在体外进行培养。这种方法获得的MSCs具有均一的表型，不表达造血和内皮的标记分子CD11b，CD31，CD45，CD34，不表达免疫共刺激分子CD80和CD86，不表达MHCⅡ类分子，但是中度表达MHCⅠ类分子，表达一些细胞粘附分子CD29，CD44，CD105和干细胞标志Sca-1的细胞。而且其具有塑料贴壁性，能够向脂肪、成骨和软骨诱导分化，符合MSCs的鉴定标准。　　 丝裂原活化蛋白激酶(MAPK，Mitogen-activated protein kinase)信号通路是调控细胞增殖分化的经典信号通路。虽然已有报道表明MAPK调节人来源的MSCs或间质细胞系等向成骨细胞分化，但所得结论之间存在着很大差别。而MAPK各条通路中，特别是ERK1/2和JNK通路，究竟在小鼠MSCs向成骨分化中起什么作用，目前还没有定论。为此，我们针对ERK1/2(extracellularsignal-regulated kinase)，JNK(c-Jun N-terminal kinase)和p38如何参与小鼠MSCs向成骨分化进行了一系列研究。实验证明，在MSCs向成骨诱导分化中，ERK1/2、JNK和p38通路均发生活化；加入ERK1/2通路阻断剂PD98059后，碱性磷酸酶(ALP)的表达在诱导早期有显著提高，而后无显著改变；加入JNK通路抑制剂JNKⅡ后不影响ALP和钙的沉积；而加入p38通路抑制剂SB203580后，可显著抑制MSCs中ALP的表达和钙的沉积。通路抑制剂对MSCs向成骨分化的影响呈剂量依赖性。另一方面的结果表明，p38通路在MSCs向成骨分化中起正调控作用，ERK通路可能在早期起负调控作用，而JNK通路在分化过程中的作用不显著。活化的T细胞也能够促进MSCs向成骨分化，并且在一定范围内，随着T细胞与MSCs的比例增加，碱性磷酸酶(ALP)的活性也随之增强。而且MAPK通路也参与了活化的T细胞诱导MSCs向成骨分化的调控，在MSCs与活化的T细胞共培养体系中加入p38通路抑制剂SB203580后，显著抑制MSCs中ALP的表达，加入ERK1/2和JNK通路抑制剂后不影响MSCs ALP的表达。　　 支架、细胞、因子是骨组织工程中研究的三大问题，支架材料作为研究的基础，必须具有良好的生物安全性和组织相容性，并且能够创造一种微环境，以利于细胞的粘附、增殖和功能的发挥。聚酯和钙磷盐是目前骨组织工程中研究的最多的支架材料。本研究中采用的两种材料，PLGA和PLGA/TCP。一方面观察两种材料在体外与MSCs的粘附特性；另一方面观察将复合骨片移植到体内后所产生的免疫反应。本实验将不同MSCs细胞浓度接种到两种生物材料上，观察到当接种浓度为2×105时接种率最高，并且在此浓度下诱导14天时，ALP活性相对较高。用统计学方法分析两种材料的接种率和ALP活性表达之间没有显著性差异，可能这两种材料的结构对细胞的支撑作用相似。但是在实验中发现，PLGA/TCP比单一的PLGA拥有更高的强度适应于体内移植。　　 已有研究表明自体MSCs与生物材料相结合，在体内移植后可以向成骨、软骨和脂肪组织等分化，但是异体MSCs的应用也是必需的，例如，在一些急性临床条件下需要大量的细胞时，而自体MSCs可能由于时间短无法满足需求。而且生物工程骨移植后成功率也是潜在的问题。有报道称体外实验证明MSCs分化后与MSCs具有相似的免疫调节功能，但是体内移植后这种免疫调节是否存在局限性，而且材料降解的产物可能会影响到异体移植骨片在体内的存活，引发机体对移植物的排斥反应。因此我们将与复合骨片中相同来源的MSCs静脉输注给受体小鼠，观察其是否能够降低异体移植所发生的免疫排斥反应。结果表明，移植1周时从病理切片观察到复合骨片移植体区域与单纯材料移植体区域有较多的炎性细胞浸润，但是尾静脉注射异体MSC后观察到炎性细胞浸润要较少，脾小结也较小较少。CD69是T细胞早期的活化标志，参与T细胞的增殖。我们在实验中观察到单纯材料和复合骨片移植后，动物体内CD69CD3在CD3+T细胞中的比例较高，而输注MSCs后显著降低了CD69的活化比例。CD8+T细胞又称为细胞毒性T淋巴细胞，能够特异性直接杀伤靶细胞。实验结果显示，在复合骨片移植的同时输注MSCs后，在24h后观察到CD4与CD8的比例要显著高于异体复合骨片移植组，提示免疫应答的正调节占优势，因此，尾静脉输注MSCs可能有利于异体复合骨片在体内的生存。资料显示，MSCs能够下调DC1对TNF-α的表达，抑制B细胞和NK细胞的活性；下调Th1对IL-2的分泌，而IL-2是介导细胞排斥的一个重要因子；上调Th2对IL-4、IL-10的表达，从而诱导免疫耐受。在实验中采用RT-PCR的方法检测了各种细胞因子在mRNA水平上的表达情况，发现给小鼠进行异体复合骨片移植的同时输注MSCs后，低表达促炎症因子TNF-α，IL-12和IL-2：而抗炎症因子IL-4，IL-10和TGF-β的表达上调；使Th1应答向Th2应答偏移，促进炎症环境向抗炎症环境转变。MSCs调节免疫应答的另一个途径是上调Treg细胞群体，或者通过Treg细胞信号通路促进IL-10，TGF-β的分泌。但是实验中并没有观测到MSCs输注和单纯的复合骨片移植后的Treg细胞数量有显著差异。