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研究背景新生儿缺血缺氧性脑病（Hypoxic Ischemic Encephalopathy,HIE）是由于围产期窒息引起的新生儿疾病。HIE在发达国家的发病率约为1.5‰,在发展中国家约为10-20‰。HIE的发病机制复杂且缺乏有效的治愈方法,因此迫切需要开发新的治疗手段。在HIE后,无氧糖酵解产生大量的乳酸。大脑中神经元利用乳酸作为能量来源,当乳酸产生过多,会持续在神经细胞内堆积,造成乳酸酸中毒,甚至细胞死亡。单羧酸转运蛋白（Monocarboxylic Acid Transporter,MCT）可以将乳酸转运到神经元中,供其通过乳酸代谢产生能量。MCT家族包含14个成员,中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）内只有MCT1、MCT2和MCT4,SLC16A1是MCT1的基因。MCT1在脑内细胞膜表面分布广泛,是乳酸的重要转运体,通过转运其他细胞产生的乳酸进入神经元,为其提供能量。Micro RNA（miRNA）通过与靶基因的3’UTR结合调控其表达。研究发现,在缺血性脑病中超过20%的miRNA发生改变,它在HIE中的作用受到越来越多的关注。我们利用生物信息学软件预测,发现miR-124-3p和SLC16A1碱基配对。在本研究中,我们建立HIE大鼠模型,在皮层和海马区域探究miR-124-3p是否可以通过调控MCT1的表达,提升脑内能量利用效能,减轻脑损伤,为HIE的临床研究和治疗提供新思路。研究目的通过探索miR-124-3p对MCT1的表达调控机制,在分子水平上阐明HIE大鼠模型中MCT1在脑内的表达变化,为临床上通过代谢调节治疗HIE提供理论依据。研究方法（1）制作HIE大鼠模型,用行为学和脑组织相关分子变化评价模型是否成功建立。将出生后7 d的大鼠右侧颈总动脉离断,0.5 h后将其放在8.0%O?,92.0%N2的缺氧装置中缺氧2.5 h,制作HIE模型。Sham组不离断颈总动脉,也不进行缺氧处理,其他操作和HIE组一致。模型制作完成后,参照Z-Longa评分,在急性期不同时间点评估大鼠神经功能损伤情况。通过悬崖回避实验检测大鼠规避风险的能力;通过爬杆实验评价大鼠运动协调能力;通过前肢悬吊实验反映大鼠双上肢的抓握能力;通过负向地力实验反映大鼠的前庭和本体感觉功能;采用网格翻转实验检测大鼠的四肢力量。q RT-PCR法检测MCT1、miR-124-3p的表达变化,Western blot法检测MCT1、HIF-1α和Cleaved-caspase3蛋白变化,验证HIE后发生脑损伤。（2）预测和大鼠SLC16A1基因相关的miRNAs。采用生物信息学软件Target Scan Human 7.1,预测与大鼠SLCl6A1基因相关的miRNAs。（3）通过双荧光素酶报告基因检测miR-124-3p和SLC16A1是否有靶向关系。在体外实验中利用转染试剂HG transgene reagent共转染miR-124-3p类似物以及野生型载体,检测各组荧光素酶活性高低,确定miR-124-3p与SLC16A1的靶向关系。（4）在大鼠模型中研究miR-124-3p对脑内MCT1表达的影响。HIE术后3 d的大鼠,右侧脑室注射miR-124-3p agomir,形成HIE+agomir组,Sham组、HIE组操作和HIE+agomir组相同,但不注射miR-124-3p agomir。检测大鼠运动功能变化,评估miR-124-3p对脑损伤的保护作用。采用q RT-PCR法检测注射miR-124-3p agomir后皮层和海马中miR-124-3p和MCT1的表达变化;免疫荧光法检测MCT1和Cleaved-caspase3的阳性信号值;Western blot法检测MCT1、HIF-1α和Cleaved-caspase3蛋白变化。研究结果（1）成功构建HIE的脑损伤模型。与Sham组相比,神经功能在HIE后0 h至48 h都有显著缺损,HIE后12 h评分最高,脑损伤最严重。在悬崖回避实验中,HIE大鼠规避风险的能力显著降低;在前肢悬吊实验中,HIE大鼠双上肢的抓握能力明显减弱;在负向地力测试中,HIE大鼠的前庭和本体感觉功能受损;在网格翻转实验中,HIE大鼠的四肢力量显著降低。在HIE大鼠皮层和海马区域,Western blot数据表明:HIF-1α、Cleaved-caspase3及MCT1在造模后12 h,24 h,3 d均有显著增加,q RT-PCR数据表明:在HIE大鼠中,皮层和海马中的MCT1 m RNA显著上升,miR-124-3p m RNA显著降低。通过行为学和相关分子变化表明HIE模型成功建立。（2）miR-124-3p和SLC16A1 3’UTR紧密相关。通过生物信息学软件,预测和SLC16A1有关的miRNAs,包括miR-425-5p、miR-29-3p、miR-124-3p;同时发现miR-124-3p与SLC16A1 3’UTR碱基互补配对。（3）利用双荧光素酶报告基因验证miR-124-3p与SLC16A1有靶向关系。构建包含SLC16A1 3’UTR的双荧光素酶载体,发现miR-124-3p agomir可以抑制荧光素酶活性,确定两者之间存在直接靶向关系。（4）侧脑室注射miR-124-3p agomir改善HIE大鼠脑内缺氧引起的脑损伤。在悬崖回避实验中,HIE+agomir大鼠规避风险的能力未发生明显变化;在前肢悬吊实验中,HIE+agomir大鼠双上肢的抓握能力明显增加;在负向地力实验中,HIE+agomir大鼠的前庭和本体感觉功能有所改善;在网格翻转实验中,HIE+agomir大鼠的四肢力量显著增强;在爬杆实验中,HIE+agomir大鼠的爬杆时间有下降趋势。q RT-PCR结果表明,miR-124-3p agomir可以上调HIE大鼠中MCT1及miR-124-3p的表达;Western blot结果表明,注射miR-124-3p agomir后12 h,HIE+agomir大鼠的皮层区域MCT1蛋白显著增加,注射模拟物后12 h、24h的海马以及24 h的皮层中,MCT1表达有上升趋势,注射模拟物后3 d,MCT1水平未发生明显改变。注射模拟物后12 h、3 d,Cleaved-caspase3及HIF-1α表达均有降低趋势。通过免疫荧光染色,检测到HIE+agomir大鼠MCT1荧光强度增加,Cleaved-caspase3荧光强度降低。以上结果表明:miR-124-3p agomir可以改善HIE引起的运动功能障碍,减少细胞死亡,改善脑损伤状态。研究结论miR-124-3p通过靶向调控MCT1的表达有效改善HIE引起的细胞死亡和运动功能障碍,提高脑内能量代谢水平,改善脑损伤。