背景与目的卒中是世界范围内第四位致死原因,是中国人群第一位致死和致残原因。缺血性卒中由于血管闭塞引起供血区域氧、糖供应障碍,引起二级损伤级联瀑布,导致神经元、胶质细胞和内皮细胞死亡。目前只有组织纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator, tPA)是具有循证医学依据的急性卒中治疗手段。但尚没有其他神经保护或者神经修复治疗手段被证明是有效的,所以寻找新型、有效的神经保护、修复手段非常有必要。随着干细胞技术的发展,人类胚胎干细胞/多能诱导干细胞已被证明能分化成各种类型的神经元,为其在卒中细胞治疗中的应用提供了基础。可行的思路是通过移植具有神经元分化能力的神经前体细胞、重建卒中后受损脑组织的神经网络。研究证实神经前体细胞移植后能在脑组织中分化成神经元并且促进神经功能的恢复的效果。然后目前限制人胚胎干细胞/多能诱导干细胞来源的神经前体细胞向临床转化的一大难题是,神经前体细胞一方面在移植后存活比例低,而存活细胞具有强大增殖活性,有导致肿瘤形成风险。有报道称γ-分泌酶抑制剂抑制Notch通路是卒中细胞治疗优化的可行手段。Notch是调节神经前体细胞增殖和分化的重要分子,干扰Notch是调节神经前体细胞的增殖与分化的一个新颖思路。缺血预适应被普遍认为是提高细胞对致死性打击的承受能力的手段。我们的前期数据表明Botch是介导缺血预适应神经保护作用的核心分子。而另一方面,最新研究表明,Botch是内源性的Notch抑制剂；可以通过限制Notch的furin样转化抑制Notch分子的剪切成熟和信号转导。基于这些基础,我们尝试通过在神经前体细胞过表达Botch来调节神经前体细胞在体外和移植后的存活、增殖和分化,考察Botch过表达是否是增加细胞移植神经修复功能的有效方法。材料与方法1.通过转座子技术使得人胚胎干细胞(human embryonic stem cells, hESCs)系H1能够稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)或者红色荧光蛋白(dsRed)。利用双细胞移植体系统,对神经前体细胞(human neural precursor cells, hNPCs)阶段的dsRed阳性hNPCs给予OGD或者NMDA预处理,而EGFP阳性hNPCs不做处理作为对照。两种细胞等量均匀混合后移植入卒中1天后的免疫缺陷小鼠梗塞皮质。通过荧光信号可以追踪移植细胞团的体积和形态成熟,通过免疫荧光染色考察细胞的增殖和存活。2.通过对缺血预处理过的人NPCs进行RNA测序筛选,并且结合前期工作基础,我们认为Botch可能是介导缺血预处理和调节细胞增殖、分化的有效靶点。通过实时定量PCR技术考察Botch在不同阶段人类细胞的表达谱,通过westernblot考察Botch在细胞、组织中的表达。3.通过慢病毒载体在hNPCs过表达Botch-EGFP,或者表达EGFP作为对照。Western blot确认过表达效率。Botch过表达对细胞增殖、死亡和成熟皮层神经元分化的作用通过免疫荧光染色鉴定。4.在体内细胞移植实验中,我们将过表达Botch的人NPCs或者对照hNPCs移植入卒中后1天的免疫缺陷NSG小鼠梗塞皮层。通过绿色荧光信号观察移植细胞团的体积、移植细胞的分布和突起形成。通过免疫荧光染色观察细胞在梗塞皮层的存活、增殖和向神经元的分化及整合。通过阶梯食物获取实验和意面获取实验观察Botch过表达的hNPCs能否促进卒中小鼠的神经功能恢复。结果1.缺血预适应可以限制移植人神经前体细胞(human neural precursor cells, hNPCs)在梗塞皮层的增殖：我们连续观察了双细胞系统移植后4周、8周、12周和16周的移植物体积、密度、移植细胞增殖和存活情况。结果表明尽管OGD/NMDA缺血预适应没能显著抑制移植物体积或者改善移植细胞的存活,但是可以短暂抑制细胞Ki67+的比例,以及降低移植细胞的密度。2. Botch可能是缺血预适应的关键分子：我们的RNA测序结果提示,Botch在OGD预处理和NMDA预处理后的hNPCs中表达上升。在hESCs向EB、hNPCs和神经元分化的过程中,hNPCs阶段Botch基因表达和蛋白水平最低。另外也有证据提示抑制Botch可以抵消缺血预适应的效应。3. Botch过表达可以抑制人神经前体细胞增殖、促进分化,并对神经元提供神经保护：我们对分化到神经前体细胞阶段的hESCs来源的hNPCs进行慢病毒载体感染,过表达Botch-EGFP或者EGFP。结果提示Botch过表达能抑制神经前体细胞和神经母细胞的增殖能力,但对细胞的存活不造成压力；并促进hNPCs向MAP2+成熟神经元、Tbrl+或者Ctip2+深层皮层神经元以及Gad67+抑制性神经元的分化。此外,hESCs来源的神经元过表达Botch可以显著提高神经元对致死性OGD损伤或者NMDA损伤的抵抗能力。4. Botch过表达限制移植hNPCs的过度增殖、促进分化和卒中后的神经功能恢复：体内细胞移植结果提示,Botch过表达能够降低移植后4周、8周细胞内的Ki67+比例并且限制移植物的体积过度增殖。同时Botch过表达能降低caspase3+细胞的比例,提示细胞存活得到改善。Botch过表达不影响移植细胞投射到皮质、胼胝体以及纹状体的投射,但能够显著促进hNPCs分化而来的神经元的突起长度。就皮层神经元分化角度,Botch过表达能促进移植的hNPCs向Tbrl+、Ctip2+皮层神经元分化。最重要的是,过表达Botch的神经前体细胞移植能够显著促进卒中后小鼠的精细运动功能的恢复。结论与意义1.缺血预适应能够短暂限制移植物增殖：我们用双细胞系统移植体系,避免了个体差异带来的实验误差。结果提示缺血预适应没有能够显著促进移植细胞的存活,这可能与缺血预适应的作用具有短时性有关。但是缺血预适应能够显著抑制移植早期的细胞增殖,从而降低移植物内的细胞总数。2. Botch介导缺血预适应效应的关键分子：缺血预适应效果具有短时性和局限性,我们通过RNAseq等技术筛选出Botch,并在功能实验中证实Botch是介导缺血预适应的核心分子。此外,在hNPCs阶段Botch表达水平最低,我们预测可以通过在hNPCs阶段过表达Botch调控其存活、增殖、分化。3. Botch过表达抑制hNPCs增殖、提供神经保护并且促进神经元分化：我们的结果提示Botch对不同分化阶段的细胞具有不同作用。Botch通过抑制Notch信号通路,抑制具有高度增殖活性的神经前体细胞和神经母细胞的增殖,促进其向皮层神经元的分化；但对分化成熟的神经元增加其对缺血打击的承受能力。同时,Botch过表达可以提高神经前体细胞向成熟神经元和深层皮层神经元、抑制性神经元的分化。Botch的这些特性共同提示Botch可能是提高细胞移植安全性、有效性的重要靶点。4. Botch过表达提高细胞移植安全性、促进神经元分化和功能恢复：过表达Botch的hNPCs在移植入小鼠梗塞皮层后过度增殖得到抑制,同时成熟细胞存活得到改善。移植细胞可以向深层皮层神经元分化,并且能形成突触结构。更重要的是过表达Botch的hNPCs移植可以显著加速卒中后小鼠的神经功能恢复,这可能跟Botch提高神经元存活、促进抑制性神经元分化中和兴奋性损伤有关。这些结果共同提示Botch可以通过对不同阶段的神经细胞发挥不同效应,使得hNPCs移植更加安全、有效。