论文部分内容阅读
经典的Wnt/β-catenin信号通路在胚胎发育和干细胞增殖方面发挥重要作用。R-spondin家族蛋白具有增强Wnt/β-catenin信号的功能,表达异常会导致一些遗传性疾病并与一些癌症的发病相关。 R-spondin的FU-CRD结构域是增强Wnt/β-catenin信号的充分必要条件。R-spondin的细胞表面受体是LGR家族的LGR4、LGR5和LGR6,以及E3泛素化连接酶ZNRF3或RNF43。目前还不清楚R-spondin与受体相互作用的机制。本论文通过X-射线晶体学衍射的方法解析了R-spondin1的FU-CRD结构域(RSPO1-2F)和LGR4胞外区(LGR4-ECD)的晶体结构,并结合生化实验和细胞实验鉴定出对R-spondin家族蛋白与受体相互作用起到关键作用的作用力和氨基酸。首先,本论文用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达了人R-spondin家族蛋白的FU-CRD结构域和受体LGR4、LGR5和LGR6的胞外区,用镍亲和层析的方法捕获目的重组蛋白,用凝胶层析的方法(Superdex200凝胶层析柱)分离不同组分,再用SDS-PAGE电泳的方法将从Superdex200所得的样品加以分析。实验结果表明RSPO1-2F、LGR4-ECD和LGR5-ECD可以在昆虫细胞中表达,RSPO1-2F和LGR5-ECD能纯化到状态比较均一的单体蛋白,LGR4-ECD的表达产物是单体和二聚体的混合物,其凝胶层析分离后所得的样品需用不含还原剂DTT的电泳上样缓冲液处理以加以区分。然后,通过将重组病毒共感染昆虫细胞的方法获得了RSPO1-2F与LGR4-ECD或LGR5-ECD的复合物,浓缩后筛选结晶条件。RSPO1-2F/LGR5-ECD没有结晶。获得RSPO1-2F/LGR4-ECD的结晶条件后,选择晶体外形较好的条件,通过改变蛋白浓度和池液组分浓度等方法优化晶体。获得较好单晶后,收集X-射线衍射数据,利用分子置换法解析结构,构建结构模型。再根据结构模型设计RSPO1-2F的突变体,和吴畏老师实验室合作用生化和细胞实验确定了对R-spondin与受体相互作用起到关键作用的作用力和氨基酸。另外,本论文还表达和纯化了ZNRF3和RNF43的胞外区,并获得了与RSPO1-2F和LGR4-ECD的三元复合物,但是没有筛选到结晶条件。本论文揭示了R-spondin家族蛋白与受体LGR4、LGR5和LGR6相互作用的机制。该研究不仅能帮助理解Wnt/β-catenin信号的激活原理,还为设计相关药物提供了结构信息,具有科学价值和应用价值。