论文部分内容阅读
目的:探讨HBc Ag在TPPⅡ作用下诱导HBV特异性CTL反应的作用及机制,HBc Ag在TPPⅡ作用下对JAK/STAT信号通路各信号分子的影响,确定其活化CTL反应的关键步骤。为临床治疗慢性乙肝的抗病毒治疗提供新的策略和实验基础。材料和方法:1.以pc DNA3.1(-)-TPPⅡ-HBc Ag质粒为模板扩增TPPⅡ和HBc Ag基因片段,插入腺病毒载体,构建含有目的基因的重组腺病毒质粒,与包装质粒和包膜质粒共转染293T细胞,包装含有HBc Ag和TPPⅡ基因的重组腺病毒Adv-HBc Ag-TPPⅡ,并纯化和鉴定。2.分离小鼠股骨骨髓细胞,药物诱导DC并培养、鉴定,采用不同的六种处理方式把DC分为六组。ELISA法检测IL-12的分泌水平,流式细胞仪检测DC表面分子CD80,CD83,CD86和MHC I分子水平;上述处理后的DC与T淋巴细胞以10:1的比例共培养,ELISA法检测IL-2、L-4、IL-10和IFN-γ的水平;流式细胞仪法检测CD8+T+IFN-γ+T细胞;CCK-8法检测T淋巴细胞增殖,LDH释放法检测特异性CTL反应。3.HLA-A2限制性小鼠随机分为6组,分别为:Adeno组(对照组);Adv-HBc Ag组;Adv-HBc Ag和阻断剂组(AG490);Adv-HBc Ag-TPPⅡ重组腺病毒组;Adv-HBc Ag–TPPⅡ和阻断剂组(AG490)组;腺病毒经小鼠后足垫注射,每周一次,共注射4次,AG490经小鼠腹腔注射,每天一次,小鼠被免疫4周后,取小鼠脾脏分离淋巴细胞并培养,CCK-8法检测T淋巴细胞增殖,ELISA法检测T淋巴细胞分泌的细胞因子(IL-2,IFN-γ和TNF-α);流式细胞仪检测T淋巴细胞内因子(IFN-γ);LDH释放法检测特异性CTL活性,Real-time PCR法和Western blot法检测JAK/STAT信号通路分子的表达。4.HBV转基因小鼠随机分为6组:Adv-HBc Ag-TPPⅡ组;Adeno组,Adv-HBc Ag组,HBc Ag组;20000IU IFN-α组以及PBS组。腺病毒经小鼠后足垫注射,每周一次,共注射4次小鼠被免疫4周,取小鼠脾脏分离淋巴细胞并培养,CCK-8法检测T淋巴细胞增殖;ELISA法检测T淋巴细胞分泌的细胞因子(IL-2,IFN-γ和TNF-α);流式细胞仪检测T淋巴细胞内因子(IFN-γ);LDH释放法检测特异性CTL活性;Real-time PCR法和Western blot法检测T-bet/GATA-3转录因子;微粒子酶免疫分析法检测AST、ALT;荧光定量聚合酶连反应法(PCR)检测HBV DNA水平;免疫组织化学和HE染色法分析肝组织炎症和HBc Ag和HBs Ag表达。结果:1.基因测序证实,HBc Ag和TPPⅡ基因成功插入腺病毒载体中且位置正确,包装重组腺病毒后转染293T细胞,Western blot法检测到目的蛋白表达。2.Adv-HBc Ag-TPPⅡ能够明显促进DC表面分子CD80,CD83,CD86和MHC I分子的表达;上调IL-12水平。Adv-HBc Ag-TPPⅡ促进T淋巴细胞分泌IL-2和IFN-γ;增强特异性CTL反应。3.Adv-HBc Ag-TPPⅡ组与其余组比较,IFN-γ(P=0.031)和IL-2(P=0.015)水平明显升高;产生CD8α+IFN-γ+和CD4+IFN-γ+的T淋巴细胞数量明显高于其他组(P值分别为0.00和0.012);T淋巴细胞增殖活性明显高于其他组(P=0.00),加入拮抗剂AG490前后,差异无统计学意义(p=0.521);LDH释放法计算杀伤率,Adv-HBc Ag-TPPⅡ组明显高于Adv-HBc Ag组和Adeno组(P=0.041);Adv-HBc Ag-TPPⅡ组JAK2,Ty K2,STAT1和STAT4的表达水平m RNA明显高于其他组,且这些分子在蛋白水平的变化也呈现出与m RNA水平的相似的变化趋势。4.与Adv-HBc Ag组、Adeno组、HBc Ag组、IFN-α组以及PBS组相比较Adv-HBc Ag-TPPⅡ组HBV DNA的抑制率明显升高(P=0.021),血清AST和ALT水平明显高于其它各组(P=0.01);PBS组和Adeno组肝细胞形态正常,肝小叶构完整,汇管区和中央静脉区炎性淋巴细胞数量少量,HBc Ag组、IFN-α组、AdvHBc Ag组与Adv-HBc Ag-TPPⅡ组小鼠肝脏汇管区和中央静脉区炎性细胞增多,而Adv-HBc Ag-TPPⅡ组炎性细胞浸润最明显;PBS组和Adeno组小鼠肝组织中HBc Ag和HBs Ag表达呈现出弥漫性分布的特点,而经HBc Ag、IFN-α、AdvHBc Ag与Adv-HBc Ag-TPPⅡ免疫后,HBc Ag和HBs Ag的表达呈逐渐减少的趋势,Adv-HBc Ag-TPPⅡ组中HBc Ag和HBs Ag减少最为显著;IFN-γ和IL-2表达水平高于其他组(P值均为0.00);CD8α+IFN-γ+和CD4+IFN-γ+的T细胞数量明显高于HBc Ag组、IFN-α组、Adv-HBc Ag组、PBS组和Adeno组(P值分别为0.032和0.00);Adv-HBc Ag-TPPⅡ组T淋巴细胞增殖活性明显高于HBc Ag组、IFN-α组、Adv-HBc Ag组、PBS组和Adeno组(p=0.00);Western blot结果提示Adv-HBc Ag-TPPⅡ组T-bet的表达明显高于HBc Ag组和PBS组,而GATA-3的水平降低,T-bet/GATA-3的比值明显增高。结论:1.成功构建重组腺病毒载体Adv-HBc Ag-TPPⅡ并包装和纯化,转染293T细胞后能够稳定表达。2.HBc Ag经TPPⅡ降解后能够促进DC成熟,并促进T淋巴细胞的增殖,诱导HBV特异性CTL免疫反应。3.Adv-HBc Ag-TPPⅡ体内免疫C57BL/6小鼠后,刺激T淋巴细胞相关细胞因子的分泌,促进T淋巴细胞增殖和CTL反应,JAK/STAT信号通路活化可能参与以上免疫反应的变化。4.Adv-HBc Ag-TPPⅡ体内免疫HBV转基因小鼠,促进T淋巴细胞分泌细胞因子(IL-2,IFN-γ和TNF-α),提高T淋巴细胞增殖能力,诱导HBV特异性CTL反应,抑制HBV DNA的复制。Adv-HBc Ag-TPPⅡ可能通过对T-bet和GATA-3的调节,影响了Th1和Th2分化。