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毒害艾美耳球虫（Eimeria necatrix）是引起鸡小肠球虫病的主要致病性种类之一,可造成鸡营养吸收障碍、饲料转化率降低、血痢,甚至是大批死亡。E.necatrix感染还常继发产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）感染,引起坏死性肠炎。对E.necatrix感染的诊断一般根据寄生部位、致病性、肠道病变、卵囊形态等,需要专业技术人员,且难于鉴别混合感染。随着分子生物学技术的发展,聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）以其快速、高效和敏感等优点被广泛应用于病原的检测和鉴别。近年来,基于纳米技术的纳米PCR（Nanoparticle-assisted PCR,nano-PCR）被证明具有更高的敏感性和特异性,但目前尚未有利用纳米PCR检测E.necatrix感染的相关报道。基于此,本研究以E.necatrix为研究对象,通过筛选特异靶基因,优化反应体系和反应条件,建立了用于特异性检测E.necatrix感染和E.necatrix孢子化卵囊的普通PCR和纳米PCR方法,并建立了同时检测E.necatrix和C.perfringens的双重PCR和双重纳米PCR方法,获得了如下结果:1.建立了基于ITS-2基因的E.necatrix普通PCR和纳米PCR检测方法:本研究选取E.necatrix ITS-2基因的部分片段分别建立了检测E.necatrix感染的普通PCR和纳米PCR检测方法,二者均能特异性扩增出E.necatrix约380 bp的目的片段;其中普通PCR的敏感性是364 pg,而纳米PCR的敏感性是3.64 pg;所建立的普通PCR扩增柔嫩艾美耳球虫、贝氏隐孢子虫、微小隐孢子虫、蓝氏贾第虫、芽囊原虫DNA时无条带,扩增毕氏肠微孢子虫和结肠小袋纤毛虫DNA时虽有条带,但不符合目的基因片段的大小;纳米PCR在扩增上述病原时均无条带;分别利用普通PCR和纳米PCR对20份临床鸡粪便样品进行E.necatrix检测,阳性率均为35.0%。2.建立了E.necatrix和C.perfringens双重PCR和双重纳米PCR检测方法:选取E.necatrix ITS-2基因的部分片段设计特异性引物,结合文献中报道的扩增C.perfringensα毒素基因的引物,建立了同时扩增E.necatrix和C.perfringens的双重PCR和双重纳米PCR检测方法,两种方法均能特异性扩增出E.necatrix约150 bp和C.perfringens约400 bp的目的片段;通过构建重组质粒p MD19-T-ITS2和p MD19-T-cpα进行敏感性试验发现,双重PCR扩增E.necatrix和C.perfringens的敏感性分别是181copies和1050 copies,而双重纳米PCR的敏感性分别是1.81 copies和105 copies;所建立的双重PCR扩增毕氏肠微孢子虫、鸽毛滴虫、贝氏隐孢子虫、柔嫩艾美耳球虫DNA时无条带,扩增蓝氏贾第虫、芽囊原虫和毕氏肠微孢子虫DNA时虽有条带,但不符合目的基因片段的大小;双重纳米PCR在扩增上述病原时均无条带;对20份人为添加DNA的样品分别进行双重PCR和双重纳米PCR检测,E.necatrix的检出率均为100%,C.perfringens的检出率分别为77.8%和100%,E.necatrix和C.perfringens混合样品的检出率分别为75.0%和100%。3.建立了用于特异检测E.necatrix孢子化卵囊的普通PCR和纳米PCR方法:通过对未孢子化卵囊和孢子化卵囊进行RNA-seq分析,发现了152个孢子化卵囊特异的基因,选取其中6个基因进行PCR验证,筛选出了2个孢子化卵囊特异基因,即ENH＿00008300和ENH＿00076120;针对这两个基因分别建立了用于特异检测E.necatrix孢子化卵囊的普通PCR和纳米PCR,其中基于ENH＿00008300基因建立的普通PCR和纳米PCR均能特异性扩增出E.necatrix孢子化卵囊约450 bp的目的片段,对于未孢子化卵囊则无扩增;普通PCR敏感性是25 ng,纳米PCR敏感性是3 ng;基于ENH＿00076120基因建立的普通PCR和纳米PCR均能特异性扩增出E.necatrix孢子化卵囊约280 bp的目的片段,对于未孢子化卵囊则无扩增;普通PCR敏感性是400 pg,纳米PCR敏感性是50 pg。综上,本研究建立了E.necatrix普通PCR和纳米PCR检测方法,以及E.necatrix和C.perfringens双重PCR和双重纳米PCR检测方法,研究结果为E.necatrix感染的快速诊断和继发C.perfringens感染时的鉴别诊断提供了技术支持;本研究还建立了用于特异性检测E.necatrix孢子化卵囊的普通PCR和纳米PCR方法,从分子水平实现了对E.necatrix孢子化卵囊与未孢子化卵囊的特异性鉴别,且具有较高的敏感性,弥补了传统形态学观察的不足。