论文部分内容阅读
目的:随着社会的发展和进步,人们生活水平的不断提高和生活方式的改变,糖尿病患病率在我国乃至全世界范围内呈逐渐上升趋势。糖尿病久病可引起眼、肾脏、神经、血管等并发症,截至目前为止,关于糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病的研究,国内外报道的很多,但关于糖尿病的骨骼肌病变,国内外研究的较少。骨骼肌是全身利用葡萄糖最重要的组织之一,也是高血糖损害的主要靶位,高血糖和下肢缺血两个因素共同引起糖尿病下肢骨骼肌病变。近年来,生长因子在骨骼肌生长发育、肌肉内血管生成及肌肉损伤后修复中的作用受到了越来越广泛的重视。随着干细胞研究的进展以及分离、纯化干细胞方法的不断改进,使采用干细胞治疗等治疗性血管生成方法在缺血部位重建有效的侧支循环成为可能,目前临床上证实自体外周血干细胞移植术是一种较好的治疗糖尿病下肢骨骼肌病变的方法。本研究通过给雄性SD大鼠腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)复制1型糖尿病大鼠模型,后结扎股动脉并离断制造糖尿病后肢缺血模型来复制糖尿病大鼠后肢骨骼肌病变模型,通过对部分大鼠实施自体外周血干细胞移植术,观察自体外周血干细胞移植术对后肢腓肠肌中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor , bFGF)表达的影响,探讨自体外周血干细胞移植术对糖尿病大鼠骨骼肌病变改善的情况,从而为临床上实施干细胞移植治疗糖尿病骨骼肌病变提供理论依据。方法:1糖尿病大鼠模型的制备健康Sprague-Dawlay(SD)雄性大鼠45只,适应性喂养1周后随机分为3组:正常对照组( A组)15只、糖尿病后肢缺血组(B组)15只、糖尿病后肢缺血后干细胞移植组(C组)15只。对B、C两组大鼠,空腹12小时后给予腹腔注射STZ 65mg/kg复制1型糖尿病模型,注射STZ72小时后测血糖,以血糖大于16.65mmol/L定为造模成功。2糖尿病大鼠后肢缺血模型的制备糖尿病造模成功后7天对糖尿病大鼠实施双后肢股动脉结扎并离断造成糖尿病大鼠后肢缺血模型,后为预防伤口感染,每天给予肌肉注射青霉素4万单位/只,共3天。在实验过程中,B组大鼠死亡2只,C组大鼠死亡1只。3干细胞动员在糖尿病后肢缺血造模成功后第7天,C组大鼠开始每天给予皮下注射粒细胞集落刺激因子G-CSF 15μg/kg,连用3天,给药后第3天采集各组大鼠内眦静脉血进行白细胞数值监测。4实施自体外周血干细胞移植术C组大鼠每只心脏采血5ml,加入抗凝管中,与Hank’s液1:1混匀后,小心加于10ml的细胞分离液之液面上,以2000转/分离心15分钟,收集界面上的细胞,放入含Hank’s液20-25ml的试管中,充分混匀后,以1500-2000转/分离心10分钟,吸去上清液,沉淀经反复洗2次即得所需细胞。用1ml无菌注射器抽取细胞,制成5x108/ml的细胞悬液,分别在C组每只大鼠左下肢腓肠肌处多点肌肉注射。5标本收集干细胞移植后4周心脏采血,后处死大鼠,并留取每只SD大鼠后肢腓肠肌中段肌肉各0.5cmX0.5cmX0.3cm,分别置于10%的福尔马林中保存,待行HE染色观察三组病理结果,行免疫组织化学染色测定后肢腓肠肌中VEGF及bFGF的表达情况。6观察指标6.1血糖的测定血糖用葡萄糖氧化酶法测定。测定步骤:准备3只试管:空白管、标准管、测定管,均加入酶、酚试剂各1.5ml,标准管加入标准液0.02ml,待测管加入待测样本0.02ml,混匀后于37℃保温15分钟,以空白管调零,测定各管吸光度值。测定参数:波长505nm,温度37℃。6.2外周血白细胞的测定取大鼠内眦静脉血1ml,利用流式细胞检测仪进行白细胞计数。6.3腓肠肌组织形态学检查常规方法制备大鼠腓肠肌光镜切片,行HE染色,镜检。6.4腓肠肌中VEGF和bFGF蛋白表达常规方法行大鼠腓肠肌免疫组织化学染色测定下肢腓肠肌中VEGF和bFGF的表达情况。6.5镜检:在光镜下观察各组骨骼肌形态学,每组选择50张切片在高倍镜下观察VEGF和bFGF蛋白的表达,VEGF和bFGF为胞浆着色,阳性细胞染成棕黄色,以不表达定为(-),低度表达定为(+),中度表达定为(++),强表达定为(+++)。7统计学处理所有数据用SPSS13.0软件处理,计量资料以均数±标准差表示,组间差异用两样本均数的t检验进行比较,两组以上比较采用单因素方差分析作统计学处理。各组间VEGF和bFGF表达的比较用非参数检验,检验的显著性用P值表示。P<0.05为差异有显著性,P<0.01为差异有极显著性。结果:1糖尿病造模后3日后大鼠出现明显的多饮、多食、多尿症状,随后体重明显下降;B组大鼠在结扎股动脉后出现趾端颜色苍白、皮温下降。干细胞移植后4周,C组大鼠左后肢趾端颜色苍白较右后肢有所缓解,皮温有所升高,C组大鼠左后肢皮温与A组相比仍有所下降。2血糖:糖尿病模型造模成功后,B组血糖明显高于A组,有显著性差异(P<0.05),C组血糖明显高于A组,有显著性差异(P<0.05), B组血糖跟C组相比无显著性差异(P>0.05)。3外周血白细胞的测定干细胞动员后第3天,C组血白细胞明显高于A组,有显著性差异(P<0.05),C组血白细胞明显高于B组,有显著性差异(P<0.05),A组血白细胞跟B组相比无显著性差异(P>0.05)。4组织学观察A组骨骼肌表现为正常的组织结构。C组左后肢骨骼肌可见细胞胞浆浓缩,核固缩,肌纤维部分区域断裂。B组骨骼肌及C组右后肢骨骼肌表现为普遍性萎缩,肌纤维变性坏死,核固缩,横纹模糊消失,间质脂肪组织增生。5 bFGF和VEGF蛋白表达的变化A组骨骼肌可见bFGF表达,阳性细胞呈棕黄色。C组及B组骨骼肌bFGF表达减弱,与A组相比有显著性差异(P<0.05)。C组左后肢骨骼肌bFGF表达比B组有所上升,两者相比有显著性差异(P<0.05)。A组骨骼肌均未见VEGF表达,C组及B组骨骼肌可见VEGF表达,B组骨骼肌VEGF表达明显低于C组,两者相比有显著性差异(P<0.05)。结论:1给予大鼠腹腔注射链脲佐菌素及结扎后肢股动脉可制造大鼠糖尿病骨骼肌病变模型。2正常骨骼肌表达bFGF,缺血可诱导骨骼肌中bFGF的表达减少,自体外周血干细胞移植可以缓解缺血诱导的骨骼肌中bFGF表达减少,从而增加了糖尿病后肢缺血大鼠的后肢血管新生,从而改善糖尿病骨骼肌病变。3正常骨骼肌不表达VEGF,缺血可诱导骨骼肌中VEGF的表达,自体外周血干细胞移植使骨骼肌中VEGF呈高水平表达,从而缓解了糖尿病大鼠的后肢缺血情况,进而缓解了大鼠骨骼肌病变的进展。