利用基因工程手段改造T细胞，用于过继免疫治疗肿瘤，具有十分广阔的发展前景。当前，全球范围内，数百家研究机构和公司都在研究如何应用嵌合抗原受体修饰T细胞（Chimeric antigen receptor T cells，CAR-T）治疗肿瘤，多数研究还是围绕着传统的二代或是三代CAR-T开展的。CAR-T细胞可以通过其表面表达的单链抗体片段识别和结合靶抗原分子，实现 T细胞对于靶抗原阳性肿瘤细胞的特异性杀伤。但目前，对于大多数肿瘤来说，很难找到一种仅在肿瘤组织中表达的理想抗原。一旦目标抗原在正常组织存在，CAR-T细胞也会对正常组织产生毒性，也就是所谓的On-target off-tumor（靶向非肿瘤组织）毒性。而且，与传统的小分子药物或是蛋白药物不同，人们在进行CAR-T细胞的过继免疫治疗时，目标是实现移植细胞的无限期地、持续地增殖。这样，才能实现对肿瘤细胞的彻底清除和防止复发。那么，这种毒性一旦产生将有可能是强烈且持续的。为了能加快CAR-T细胞领域的发展，构建特异性更强、更加安全的CAR-T已成为当前CAR-T技术临床前研发的关注重点。之前，我们构建了针对肝细胞癌重要标志物Glypican3（GPC3）的CAR-T细胞，并在临床前研究中证明它可非常有效地清除GPC3阳性的肝癌细胞。我们也推动该项目进行了临床研究。但由于检测的灵敏度、个体的差异、人体组织的复杂度等等，我们不敢确定GPC3在正常组织中完全没有表达。我们认为如果能在它的基础上发展更为安全的CAR-T细胞治疗手段，将是非常有益的尝试。因此，本研究提出了两种解决方案：一种是构建GPC3/ASGR1双靶向性的CAR-T细胞，使其只有在同时识别两种抗原时，才能被完全激活；另一种是构建了带有阻断肽修饰的CAR-T，在未经酶切作用前不具有抗原识别的能力，但在肿瘤微环境中的蛋白酶作用下阻断肽被酶切，从而使CAR-T发挥识别并杀伤肿瘤的能力。　　第一部分针对GPC3和ASGR1的双靶向抗原受体修饰T细胞的构建及对肝细胞肝癌的免疫治疗　　之前，本实验室曾报道，利用靶向GPC3的嵌合抗原修饰T（CAR-T）细胞来清除移植到免疫小鼠皮下的肝细胞肝癌移植瘤。但至于这种CAR-T细胞是否会在临床中产生on-target off-tumor，我们并不清楚。因此，我们设计了一种双靶向CAR-T，以求降低可能产生的上述靶向非肿瘤组织风险：在细胞表面同时表达识别GPC3和ASGR1的嵌合抗原受体—识别GPC3的嵌合抗原受体胞内段仅包含CD3ζ结构域，而识别ASGR1的嵌合抗原受体胞内段则表达串联的CD28和4-1BB受体的胞内信号传导结构域。体外实验结果表明，双靶向CAR-T细胞对于ASGR1+GPC3-肿瘤细胞并不会产生细胞毒性，但对于ASGR1-GPC3+或GPC3+ASGR1+肝癌细胞却均能产生类似的细胞毒性。有趣的是，虽然对于ASGR1-GPC3+或GPC3+ASGR1+肝癌细胞的毒性作用几乎没有差别，但在体外实验中，与GPC3+ASGR1+肿瘤细胞接触后，双靶向CAR-T细胞展现出比仅表达一种嵌合抗原受体的CAR-T细胞具有更强的细胞因子分泌、增殖及抗凋亡的能力。此外，我们还建立了两种GPC3+ASGR1+肝细胞肝癌皮下移植瘤模型，并继而进行了过继免疫治疗实验。结果表明，双靶向CAR-T细胞相较于单靶向CAR-T细胞具有更强的抑瘤活性和更长的体内存活时间。综上所述，文中提及的双靶向CAR-T细胞，只有在同时识别了GPC3和ASGR1之后才能被完全激活；这样的设计既降低了潜在on-target off-tumor可能带来的毒性，又保留了CAR-T细胞对于GPC3+ASGR1+肝细胞肝癌的杀伤活性。　　第二部分瘤内特异激活的阻断肽修饰嵌合抗原受体T细胞的构建及其对肿瘤靶向杀伤效果的探索　　嵌合抗原受体修饰T细胞通过其细胞表面表达的单链抗体来识别、结合靶抗原，从而实现使 T细胞重定向作用于表达靶抗原的肿瘤组织。所以，嵌合抗原受体修饰 T细胞技术实际上是一种抗体技术，也存在着利用抗体技术治疗肿瘤所面临的问题：当前没有一种肿瘤特异性抗原仅在肿瘤组织中表达，而不在正常组织中存在，仅针对某个单一抗原设计嵌合抗原受体进行过继免疫治疗，势必会出现嵌合抗原受体T细胞出现on-target off-tumor，攻击正常组织。因此，缺少理想靶点是该技术发展的瓶颈。由于肿瘤组织中常过表达一些蛋白酶，用于酶切胞外基质、促进肿瘤的转移；我们想利用肿瘤特殊的微环境，设计一种可被肿瘤特殊微环境激活的CAR-T细胞。在本实验曾报道的针对GPC3的三代CAR的基础上，设计了一种带有阻断肽修饰嵌合抗原受体T细胞：在CAR的前端，用可被特殊的丝氨酸蛋白酶酶切的短肽底物（Substrate）连接了一段改造自GPC3的,与GC33有一定结合能力的短肽（MASK）。上述酶切底物可被肿瘤组织中高表达的uPA和MTSP1酶切，使MASK肽得以释放，继而产生传统的三代CAR-T细胞，集中于高表达uPA和MT-SP1的肿瘤组织中杀伤肿瘤。实验结果表明，MASK肽可基本阻断GC33单链抗体的抗原结合能力，在外源uPA、MT-SP1或是含有上述酶的肿瘤细胞上清加入后能够被有效释放，但并不完全。因此，虽然MASK-CAR-T细胞展现出了针对GPC3+的特异性的杀伤作用及促炎细胞因子分泌，但其效应水平要低于传统的三代CAR-T细胞。另外，MASK肽段虽能与嵌合抗原受体中的单链抗体部分结合，但并未引起MASK-CAR-T细胞的自我激活和自相残杀，其体外扩增能力与传统CAR-T细胞一致。综上所述，这种阻断肽修饰嵌合抗原受体T细胞能够在高表达uPA、MT-SP1的肿瘤组织中被切除阻断肽，有望集中于肿瘤组织中，在与靶抗原结合后发挥杀伤效应；而游离于正常组织中的未被切除阻断肽的MASK-CAR-T细胞则不会发挥免疫效第二部分瘤内特异激活的阻断肽修饰嵌合抗原受体T细胞的构建及其对肿瘤靶向杀伤效果的探索　　嵌合抗原受体修饰T细胞通过其细胞表面表达的单链抗体来识别、结合靶抗原，从而实现使 T细胞重定向作用于表达靶抗原的肿瘤组织。所以，嵌合抗原受体修饰 T细胞技术实际上是一种抗体技术，也存在着利用抗体技术治疗肿瘤所面临的问题：当前没有一种肿瘤特异性抗原仅在肿瘤组织中表达，而不在正常组织中存在，仅针对某个单一抗原设计嵌合抗原受体进行过继免疫治疗，势必会出现嵌合抗原受体T细胞出现on-target off-tumor，攻击正常组织。因此，缺少理想靶点是该技术发展的瓶颈。由于肿瘤组织中常过表达一些蛋白酶，用于酶切胞外基质、促进肿瘤的转移；我们想利用肿瘤特殊的微环境，设计一种可被肿瘤特殊微环境激活的CAR-T细胞。在本实验曾报道的针对GPC3的三代CAR的基础上，设计了一种带有阻断肽修饰嵌合抗原受体T细胞：在CAR的前端，用可被特殊的丝氨酸蛋白酶酶切的短肽底物（Substrate）连接了一段改造自GPC3的,与GC33有一定结合能力的短肽（MASK）。上述酶切底物可被肿瘤组织中高表达的uPA和MTSP1酶切，使MASK肽得以释放，继而产生传统的三代CAR-T细胞，集中于高表达uPA和MT-SP1的肿瘤组织中杀伤肿瘤。实验结果表明，MASK肽可基本阻断GC33单链抗体的抗原结合能力，在外源 uPA、MT-SP1或是含有上述酶的肿瘤细胞上清加入后能够被有效释放，但并不完全。因此，虽然MASK-CAR-T细胞展现出了针对GPC3+的特异性的杀伤作用及促炎细胞因子分泌，但其效应水平要低于传统的三代CAR-T细胞。另外，MASK肽段虽能与嵌合抗原受体中的单链抗体部分结合，但并未引起MASK-CAR-T细胞的自我激活和自相残杀，其体外扩增能力与传统CAR-T细胞一致。综上所述，这种阻断肽修饰嵌合抗原受体T细胞能够在高表达uPA、MT-SP1的肿瘤组织中被切除阻断肽，有望集中于肿瘤组织中，在与靶抗原结合后发挥杀伤效应；而游离于正常组织中的未被切除阻断肽的MASK-CAR-T细胞则不会发挥免疫效应。本设计在保留了T细胞靶向杀伤肿瘤的能力的同时，降低了CAR-T细胞产生靶向非肿瘤组织的可能性。