WT1基因（Wilms’瘤基因）作为一种重要的转录调控因子参与许多肿瘤特别是白血病的发生。WT1 mRNA经过选择性剪接可以编码四种同源异构体。在第五外显子处,编码17个氨基酸插入调控区与锌指区之间,可把WT1表达蛋白分为+17AA及-17AA两种异构体。在第九外显子末端即第三和第四锌指结构之间插入KTS（Lys-Thr-Ser）三个氨基酸,从而又可将WT1表达蛋白分为+KTS和-KTS两种异构体。通过不同的组合,可细分为四种主要的剪接体,这四种不同的含锌指结构的DNA结合蛋白分别为+17AA/+KTS,+17AA/-KTS,-17AA/+KTS,-17AA/-KTS,以下分别简称为（+/+,+/-,-/+,-/-）。许多研究表明,四种异构体在转录、剪接和调控细胞基本功能如增殖,分化及凋亡方面功能各不相同。许多研究证实WT1在各类白血病中高表达,提示其参与了白血病的发生。然而其究竟是作为被异常激活的癌基因参与白血病的恶性转变过程,或是作为诱导分化所必须的生理性表达基因而被动参与白血病的发生,至今仍不清楚。早期研究表明,WT1只在正常骨髓CD34⁺细胞中表达,而在分化成熟细胞中表达消失。Ellisen等则证实正常造血细胞分化成熟过程中WT1出现第二次高表达。那么真实情况如何,特别是细胞分化成熟的不同阶段四种异构体的表达比例如何,目前尚不清楚。急性髓系白血病（AML）细胞群是由不同分化阶段的白血病细胞组成,其中最原始的细胞为白血病干细胞（leukemia stem cell,LSC）。虽然LSC所占比例极少,但唯独其具有维持白血病细胞克隆的作用。AML的恶性转化发生在干细胞水平,这种发生恶性转化的干细胞的细胞和分子遗传学改变决定了白血病细胞克隆的分化特点,从而形成不同亚型的AML。LSC与正常造血干细胞（HSC）有许多相似之处,它具有自我更新能力和有限的分化潜能,同时又具有其自身独特的特征。LSC除具有与正常造血干细胞相同的表型如CD34⁺,CD38^-外,还具有其特征性表型特征:CD90^-,CD117^-,CD123⁺。目前认为CD123⁺特异性表达于LSC,因此CD123⁺可作为白血病干细胞的标记。Gilliland描述了引起AML的二次打击模式,即细胞激酶突变激活和转录因子功能的改变是白血病发生的基础。近年来研究发现WT1在各类白血病中异常的高表达,但是关于WT1基因及其四种异构体在白血病干细胞中的表达目前国内外尚未见报道。本文采用特异性好灵敏度高的实时荧光定量RT-PCR技术,同时借助流式细胞分选手段对正常造血过程中不同细胞亚群及白血病细胞系HL-60诱导分化过程中总WT1基因及其17AA+,KTS+两类异构体的表达水平进行检测,β—actin作为内参照。在此基础上计算出WT1（+/+）、WT1（+/-）、WT1（-/+）、WT1（-/-）四种异构体在细胞分化过程中表达水平及比例的变化。探讨WT1基因与细胞分化的关系,阐明WT1基因在造血系统细胞增殖、分化中发挥的功能。进一步利用流式分选获得急性髓系白血病患者CD34⁺CD38^-CD123⁺和CD34⁺CD38^-CD123^-细胞,检测其中WT1表达水平及其异构体构成比例,同时与正常干细胞对比分析,旨在为进一步探讨WT1在白血病发生机制中的作用奠定基础。第一部分正常人骨髓不同细胞群中WT1基因表达及其异构体比例研究1、标准曲线的建立以阳性标准品进行四条标准曲线的建立,其相关系数均达0.996以上。采用实时荧光定量RT-PCR方法检测18例正常人骨髓标本中CD34⁺CD38^-CD123^-细胞群（干细胞）、CD34⁺CD38⁺细胞群（祖细胞）、CD33⁺CD14⁺细胞群（单核细胞）、CD15⁺CD11b⁺细胞群（粒细胞）、CD20⁺CD5^-细胞群（B细胞）、CD20-CD5⁺细胞群（T细胞）中总WT1、WT1（+17AA）及WT1（+KTS）的表达。由于17AA与KTS的选择性剪接应当是彼此独立的,因此WT1四种异构体各自的比例可以通过17AA+,17AA-、KTS+、KTS-之间比例相乘而计算出来。2、正常骨髓不同细胞亚群WT1表达水平与阳性对照K652细胞系（4.67×10³±2.95）相比,CD34⁺CD38^-CD123^-、CD34⁺CD38⁺、CD15⁺CD11b⁺和CD33⁺CD14⁺细胞群中均存在WT1的低表达且依次逐渐降低,其中CD34⁺CD38^-CD123^-细胞群表达水平最高,为7.92×10⁴±1.07,CD33⁺CD14⁺细胞群表达水平最低,为7.08×10^-5±1.25。在CD20⁺CD5^-和CD20 CD5⁺细胞群未检测到WT1表达。3、正常骨髓不同细胞亚群+17AA、+KTS异构体表达水平及其比例每一细胞亚群中17AA+、KTS+两类异构体表达水平高低与其总WT1的表达趋势一致,也表现为CD34⁺CD38^- CD123细胞群表达水平最高,CD33⁺CD14⁺细胞群表达水平最低。正常人骨髓中CD34⁺CD38 CD123^-和CD34⁺CD38⁺细胞群以+17AA、+KTS为主;而在CD33⁺CD14⁺和CD15⁺CD11b⁺细胞群中+17AA、+KTS两类异构体的比例明显下降,其中以+17AA比例下降更为显著。4、正常骨髓不同细胞亚群WT1四种异构体表达水平及比例K562细胞株、干细胞及祖细胞群均以WT1（+/+）异构体表达为主,所占比例分别为0.40±0.09,0.37±0.03,0.32±0.05,组间比较有显著性差异（P＜0.05）;粒细胞和单核细胞群中则以WT1（-/-）异构体比例为主,所占比例分别为0.39±0.04,0.36±0.05。第二部分HL-60细胞系诱导分化过程中WT1基因及其异构体比例变化1、ATRA诱导HL-60向粒细胞方向分化依据细胞生长曲线及NBT还原率确定了ATRA诱导HL-60分化的最适浓度（1μmol/L）。分别通过细胞形态学检测,NBT还原实验及细胞表面分化抗原检测来判定细胞的分化情况。在细胞诱导分化过程中,CD11b阳性率及NBT还原率逐渐增加。并且被诱导的细胞出现了肾形核、分叶核、蚕豆核等粒细胞核形,充分说明ATRA可诱导HL60细胞沿着粒细胞方向分化。2、ATRA诱导HL-60分化过程中WT1表达水平的变化检测药物作用不同时间组HL-60细胞WT1基因表达水平。随着药物作用时间的增加,WT1表达水平逐渐降低,0小时其表达水平为4.67×10^-3±1.11×10³,96小时达7.53×10^-4±2.30×10⁴,Western blot检测总WT1蛋白显示:随着药物诱导时间的增加,WT1蛋白表达逐渐减弱。3、ATRA诱导HL-60分化过程中17AA+、KTS+异构体表达水平及比例的变化17AA+、KTS+两类异构体表达水平的变化与总WT1的变化趋势一致,表现为随着诱导时间增加,两类异构体的表达水平及所占总WT1比例逐渐下降。4、ATRA诱导HL-60分化过程中WT1四种异构体表达比例的变化HL-60细胞分化过程中,WT1（+/+）比例逐渐下降,0小时占0.32±0.06,96小时比例为0.17±0.03,48,72,96小时组与药物作用0小时组比较有显著性差异。而WT1（-/-）比例逐渐上升,0小时为0.19±0.04,96小时达0.34±0.05。72及96小时组与药物作用0小时组比较有显著性差别。另外两种异构体比例变化各组之间没有显著性差异。第三部分WT1基因及其异构体在急性髓系白血病患者骨髓不同细胞群中的表达1、急性白血病患者骨髓中CD34+CD38-CD123+/CD123-细胞中WT1表达水平在急性髓系白血病患者原始细胞中,CD34⁺CD38^-CD123⁺细胞亚群的表达水平为3.39×10^-2±3.38,CD34⁺CD38^-CD123细胞亚群为5.25×10³±5.62;而正常干细胞（CD34⁺CD38^- CD123）的表达水平最低,为7.94×10^-4±1.35,方差分析显示三者之间有显著性差异（P＜0.05）。2、急性白血病患者骨髓中CD34+CD38-CD123+/CD123-细胞中17AA+、KTS+异构体表达水平及比例17AA+、KTS+两类异构体表达水平的高低与总WT1的表达趋势一致。两类异构体均表现为在患者CD34⁺CD38 CD123⁺原始细胞的表达水平最高,正常造血干细胞最低。各亚群细胞中均是以17AA+为主,组间比较无显著差异。KTS+异构体比例在正常干细胞中表达最高为0.57±0.04,在患者CD34⁺CD38^-CD123^-细胞群中所占比例最低为0.50±0.12,两组比较有显著性差异（P＜0.05）,而患者CD34⁺CD38^-CD123⁺细胞群与其它两组比较无显著差异。3、急性白血病患者骨髓中CD34+CD38-CD123+/CD123-细胞中WT1四种异构体比例急性髓系白血病患者原始细胞中CD34⁺CD38 CD123⁺和CD34⁺CD38^-CD123^-细胞亚群及正常干细胞（CD34⁺CD38 CD123）中四种异构体的组成比例相似,各组之间比较无显著性差异（P＞0.05）4、患者骨髓CD34+CD38-CD123+细胞群中WT1基因表达及其所占原始细胞群的比例与预后的关系47例急性髓系白血病患者骨髓中CD34⁺CD38 CD123⁺细胞群WT1的表达水平,与患者的性别、年龄、FAB分型特征,原始细胞数无明显相关性（P＞0.05）。WT1基因表达与预后的关系:CD34⁺CD38^-CD123⁺细胞群中WT1表达水平≥0.06（中位数）的患者CR率为40.9%,＜0.06（中位数）的患者CR率为57.8%,两组之间CR率无显著性差异（P＞0.05）。患者骨髓CD34⁺CD38^-CD123⁺细胞群所占原始细胞群的比例（0.03%～4.5%,median:0.1%）与预后:以0.1%（中位数）为界限,41例初发急性髓系白血病患者跟踪随访,比例≥0.1%组（n=19）较＜0.1%组的患者（n=22）累计生存率低,中位生存期短（P=0.0381）。结论1、在正常人骨髓细胞及白血病细胞系HL—60诱导分化过程中总WT1的表达随着细胞分化程度提高而降低。2、在分化程度较低的造血细胞中WT1基因的表达以17AA+、KTS+及WT1（+/+）异构体为主,而较成熟的细胞群中以-17AA、-KTS及WT1（-/-）异构体为主。造血细胞可能通过四种异构体比例的调整而发挥抑制或促进分化的作用。3、急性髓系白血病患者CD34⁺CD38^-CD123⁺细胞亚群中WT1基因的异常高表达,可能是WT1基因作为转录因子在早期就参与白血病发生的一种表现。4、急性髓系白血病患者CD34⁺CD38^-CD123⁺细胞亚群可能代表患者体内极少数的肿瘤干细胞,它在原始细胞中的比例大小直接影响预后。