杆状病毒是节肢动物，特别是鳞翅目昆虫重要的病原微生物。对目前已经完成全基因组测序的41株杆状病毒基因组进行分析，发现这些基因组中均包含的29个基因，组成了杆状病毒核心基因，并分别被分成了与转录、复制相关的基因，病毒结构基因，或者是辅助基因以及功能未知基因共五类。38K基因便是这29个核心基因之一并且属于功能未知基因。本文选择苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)38K基因(ac98)作为研究对象，对其转录、表达以及亚细胞定位与病毒结构定位进行了系统的研究；并且综合利用了Bac-to-Bac系统和ET同源重组系统，构建了缺失38K基因的重组病毒，研究38K在病毒复制中所起的重要作用；在这个基础上，相继构建出4株38K点突变的重组病毒和系列的38K截短型的重组病毒，对38K蛋白的功能进行了更深一步的研究；最后还利用双向酵母双杂系统和免疫共沉淀等技术对38K蛋白与其他的病毒核衣壳蛋白的相互作用进行了研究。 38K位于AcMNPV病毒基因组85,021nt～85,983nt之间，全长963 bp，编码320个氨基酸，预计编码蛋白的分子量大小为38.021 kDa。在38K基因起始密码子ATG的上游存在一个典型的杆状病毒早期启动子元件CAGT和两个典型的杆状病毒晚期启动子元件TAAG，在终止子TAA的下游并没有发现典型的polyA加尾信号。38K蛋白氨基酸序列比对表明，AcMNPV 38K蛋白的氨基酸序列在杆状病毒中具有非常高的保守性，其中与PlxyMNPV、RoMNPV、BmNPV、MvMNPV的同源蛋白的相似性超过了97％。保守结构域分析结果表明，38K可能属于一种病毒磷酸酶家族，并且具有一个潜在的卤代酸脱卤酶超家族磷酸酶的结构域，暗示其可能具有磷酸酶活性。 Northern blot的结果显示，38K基因的转录本在病毒感染后9 h就能得到检测，在24 hpi丰度达到了最高，一直持续到72 hpi仍未衰退。5RACE结果表明38K基因转录起始位点在ATG上游-30 nt～-27 nt的杆状病毒典型晚期启动子模序TAAG中的第一个嘌呤碱基A。这些结果表明38K是一个晚期转录基因。通过PCR的方法扩增得到38K全长读码框序列，将其克隆到原核表达载体pPROEX HTa上，在大肠杆菌中表达出分子量约为40 kDa，的融合了六个组氨酸的His-38K融合蛋白。以纯化的His-38K融合蛋白为抗原，免疫新西兰大白兔，得到38K抗血清。免疫印迹分析表明，该抗血清能与感染AcMNPV病毒的细胞总蛋白样品发生特异性反应。在AcMNPV感染的细胞中检测到的38K蛋白大小约为38 kDa，该蛋白能在18 hpi被检测出来，并一直持续到72 hpi。 为了确定38K蛋白在受病毒感染细胞中的定位，我们把38K基因与绿色荧光蛋白基因进行融合表达，通过激光扫描共聚焦实验，我们发现38K蛋白首先出现在受病毒感染细胞的核外围，然后逐渐集中在核中央。接着，我们用Western blot和免疫电镜对38K蛋白在病毒结构中的定位进行了分析。将AcMNPV病毒粒子BV和ODV进行囊膜(E)和核衣壳(NC)的分离，以38K抗血清进行免疫印迹实验，结果表明38K特异存在于BV和ODV的核衣壳结构成分中而不在囊膜结构成分中。采用常温包埋的免疫电镜制样方法处理AcMNPV感染的细胞，发现与38K抗血清结合的金颗粒特异聚集于病毒的核衣壳上，更进一步说明了38K是一个核衣壳结构蛋白。 为了进一步研究38K的生物学功能，利用Bac-to-Bac系统和ET同源重组系统，在AcMNPV Bacmid基因组中成功敲除了38K基因，构建出缺失了38K基因的重组病毒。同时，通过转座的方法，在缺失了38K基因的重组病毒中，把38K基因在多角体位点进行了插入补回，构建出38K基因补回型的重组病毒。当把野生型、38K基因缺失型以及38K基因补回型三种重组病毒转染Sf9细胞，发现38K基因缺失型重组病毒不能产生有感染性的病毒粒子；而38K基因补回型重组病毒产生感染性病毒粒子的能力与野生型的无异。狭缝杂交实验以及实时荧光定量PCR实验证明，38K基因的缺失并没有影响病毒DNA的复制。而通过对病毒感染细胞的超薄切片电镜分析，我们发现在缺失了38K基因的重组病毒所感染的细胞中并没有病毒粒子的形成，而只观察到类似核衣壳的空杆子。以衣壳蛋白VP39的抗体为一抗进行了免疫电镜分析，证实了这些杆子就是空的病毒核衣壳，从而证明了38K基因的缺失导致了病毒粒子装配的中断。而同时电镜实验表明，38K基因补回型病毒能产生正常的病毒核衣壳，与野生型的无异。以上所有的实验结果都表明了38K在病毒核衣壳的装配中起重要的作用，是杆状病毒生活周期的一个必需基因。我们利用定点突变技术分别对38K的4个保守氨基酸位点进行了突变，即分别把Motif Ⅰ：D140×D142、Motif Ⅱ：S177、Motif Ⅲ：K251和MotifⅣ：D275D276突变成丙氨酸，构建了4株点突变重组病毒。病毒复制实验表明，只有突变了Motif Ⅰ的重组病毒能形成可感染性的病毒粒子，其余3株点突变重组病毒并不能进行病毒的增殖。 在利用同源重组技术缺失了38K的基础上，通过位点特异性重组技术，将38K蛋白分成不同部分补回到38K缺失型病毒中，构建出6株部分表达38K蛋白的重组病毒，病毒复制实验表明，只有当部分表达38K蛋白的羧基端(C端)的时候才能回复38K的功能。在这个基础上，我们再次把38K蛋白从氨基端(N端)逐步截短进行补回，再次构建出5株逐步截短的38K补回型重组病毒。随着补回的38K蛋白的逐步截短，病毒增殖的能力逐渐减弱，当截短至剩下羧基端150个氨基酸时，病毒完全失去增殖能力。同时，通过病毒空斑实验对这些重组病毒所能产生的病毒空斑的直径大小进行了比较，实验结果也与前面的病毒复制实验结果吻合。这些结果说明38K的N端对病毒的复制并不是至关重要的，而C端则是重要的。 通过双向酵母双杂交系统和免疫共沉淀技术对38K与杆状病毒其他的核衣壳结构蛋白之间的相互作用进行了研究。酵母双杂交的实验结果表明，38K与VP1054、VP39、AC142以及自身有强的相互作用，而与VP80以及VLF-1有弱的相互作用。利用免疫共沉淀技术，我们验证了38K与VP1054、VP39，VP80以及自身之间的相互作用。