帕金森病(Parkinson’s Disease, PD)是好发于中老年人的一种渐进性中枢神经系统退行性疾病，主要临床表现为静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态异常。自1817年首次报道PD以来，医学界对该病的研究已有长达近200年的历史。PD病理诊断的金标准是形成路易体(Lewy body, LB)，而研究发现α-突触核蛋白(α-synuclein，α-syn)是LB的重要组成成分。生理情况下，正常的α-syn参与SNARE(SolubleN-ethyl-maleimide sensitive fusion protein attachment protein receptor)复合体的形成和调节神经递质的释放；在特定情况下α-syn发生聚合形成不溶性的低（寡）聚体形式，并发生淀粉样纤维化，对多巴胺(Dopamine, DA)能神经元产生神经毒性，导致神经元死亡。目前已经明确编码α-syn的基因(α-synuclein gene，SNCA)突变是常染色体显性遗传(autosomal dominant，AD)性PD的致病因素。动物研究发现在α-syn转基因小鼠和果蝇能复制出PD的病理和症状，因此，尽管α-syn导致PD的具体机制尚不完全清楚，但科学界一致认为α-syn与PD发病具有因果关系。戈谢病(gaucher disease，GD)是一种常染色体隐性遗传病（Autosomal recessivedisorder，ARD），是由于葡萄糖脑苷脂酶基因(glucocerebrosidase gene，GBA)突变引起溶酶体酶-β-葡萄糖脑苷脂酶(glucocerebrosidase，GCase)缺乏，导致其代谢底物葡萄糖脑苷脂(Glucosylceramide，GluCer)在体内单核吞噬细胞系统中聚集，最终导致的一种代谢障碍性疾病。近10年来在一些个案报道、前瞻性研究中不断发现在GD患者中出现帕金森病样的症状，或伴存PD。此后的临床研究发现，PD患者中有较高的GBA突变率，尸检也发现PD患者GBA突变率达20%。在机制研究上，发现GBA突变可以引起α-syn水平增高，从而增加PD的易感性。近年来发现，在GD并发PD症状的患者脑组织切片中存在GCase与α-syn双阳性的路易体。研究表明，GBA突变影响α-syn发生改变可能与GD并发PD密切相关，但其机制尚不完全清楚。目前主要有两种假设，一种假设认为GBA基因突变导致GCase功能丧失，GluCer在体内累积，使细胞膜脂质结构发生改变，干扰了α-syn在细胞膜与受体的结合，使得α-syn的异常聚集，但缺乏直接证据。另一种假设认为GBA基因突变导致蛋白错误折叠，增加了泛素蛋白酶体系统(ubiquitin proteasome system，UPS)的负担，使得异常蛋白的降解减少，引起突变型α–syn水平升高，从而增加PD的易感性。以上研究表明GBA突变后对α-syn的影响可能与PD发病有密切关系，但是其机制尚不清楚。本课题首先通过构建GCase RNA干扰载体，下调GCase表达，模拟GBA功能缺失性突变；探索GBA功能缺失性突变对α-syn的影响，初步研究GCase干扰影响α-syn的可能机制，以期阐明GD与PD之间的联系，为临床治疗PD寻找新的靶点提供理论基础。本论文分3个部分，具体如下：第一部分GCase RNAi及沉默效应的鉴定目的：构建靶向GCase的RNA干扰载体，并将其转染SH-SY5Y细胞，鉴定沉默效应，为后续实验提供研究工具。方法：根据既往文献报道及Genbank公布的数据设计合成3个siRNA，瞬时感染SH-SY5Y细胞，利用Western blotting初步评价3个siRNA的干扰效果。筛选出干扰效果较好的siRNA合成shRNA，构建携带GCase shRNA的质粒pLKO.1，进行慢病毒包装。将包装好的慢病毒颗粒感染SH-SY5Y细胞，利用嘌呤霉素抗性筛选稳定感染的细胞（GCase shRNA组）。阴性对照组(Control)携带的shRNA与目的基因无同源性，正常对照组(Normal)不进行慢病毒转染。采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组中GCase mRNA水平。采用Western blotting检测各组中GCase蛋白水平，并检测GCase酶活性。采用荧光免疫组化检测GluCer的水平。采用MTT法检测各组细胞的存活和生长能力。结果：构建的3个siRNA均有干扰效果，经过Western blotting初步检测，siRNA1(1452)具有较好的干扰效果。以siRNA1(1452)构建pLKO.1-GCase-shRNA，并进行慢病毒包装，进行后续实验。慢病毒感染细胞后，经过嘌呤霉素筛选，获得了稳定感染GCase shRNA慢病毒的SH-SY5Y细胞。感染后GCase mRNA的变化：经RT-PCR鉴定，Normal组与Control组比较，GCase mRNA水平无显著差异；而GCase shRNA组GCase mRNA水平显著低于Control组和Normal组，与Control组比较，GCase shRNA组mRNA抑制率达68%。GCase蛋白水平变化：经Western blotting鉴定Normal组与Control组比较GCase蛋白水平无显著差异，而GCase shRNA组GCase蛋白水平显著低于Control组和Normal组，与Control组比较，GCase shRNA组GCase蛋白水平下降70%。GCase酶活性变化：Normal组与Control组比较，GCase酶活性无显著差异；与Control组比较，GCase shRNA组GCase酶活性显著降低，酶活性下降65%。GluCer水平变化：Normal组与Control组比较，GluCer水平无显著改变；与Control组比较，GCase shRNA组GluCer阳性细胞数显著增加（171%）。细胞存活及生长能力：经MTT法检测，Normal组与Control组比较，细胞活性无显著差异；与Control比较，GCase-shRNA组细胞活性分别下降了6.15%(24h)、18.43%(48h)、25.54%(72h)、25.43%(7d)。结论：构建的3个GCase siRNA，瞬时转染均能达到干扰效果；经初步筛选将干扰效果较好的siRNA构建shRNA，进行慢病毒包装。干扰GCase的慢病毒感染SH-SY5Y细胞后，能稳定有效的干扰GCase mRNA的表达，下调GCase的表达。GCase水平下调后GCase酶活性下降，引起GluCer分解减少，细胞内GluCer积累，7d内细胞存活及生长能力受到不同程度的影响。第二部分RNA干扰GCase对α-突触核蛋白水平影响的研究目的：利用第一部分实验得到的RNA干扰载体，观察GCase RNAi后细胞中α-syn水平的变化，并探索GCase RNAi影响α-syn的可能机制，以期为阐明GD与PD之间的联系。方法：实验分4个组，Normal组、Control组、GCase shRNA组，以及亮抑酶肽处理组(Leu)；Normal组、Control组与GCase shRNA组细胞来源于第一部分实验，Leu组为Control组细胞给予Leu处理。分别采用Realtime PCR和Western blotting检测各组中α-syn mRNA水平以及蛋白水平的变化。采用免疫荧光双标法检测各组细胞中溶酶体标记物LAMP1和α-syn的表达和共存情况。进一步采用Western blotting检测各组中可溶性α-syn(T-soluble α-syn)和不溶性α-syn(T-insoluble α-syn)蛋白水平。结果：Western blotting结果表明：α-syn在正常SH-SY5Y细胞中有表达，在18KD可见蛋白条带；与Normal组比较，Control组中α-syn蛋白水平未见显著差异；而与Control组和Normal组比较，GCase shRNA慢病毒转染后α-syn蛋白表达量显著增加(为Control组的133.9%±5.573%)。Realtime PCR检测结果表明：Normal组、Control组、GCase shRNA组，三组中α-syn mRNA水平未见显著差异。荧光免疫组化显示：与阴性对照组(30.96%±3.184%)比较，GCase shRNA慢病毒感染后α-syn阳性细胞数含量显著增加(46.49%±2.849%)。与GCase shRNA组比较，给予溶酶体抑制剂亮抑肽酶(Leu)处理后α-syn阳性细胞数含量(65.78%±3.208%)进一步增加。进一步分析发现Leu组LAMP-1及α-syn双阳性细胞数含量为25.78%±2.475%，较control组(17.24%±2.332%)显著增加；而GCase shRNA组LAMP-1及α-syn双阳性细胞数含量为38.99%±2.602%，较Leu组显著增加。进一步采用Western blotting检测T-soluble α-syn蛋白水平结果表明：与Normal组比较， Control组T-soluble α-syn蛋白水平无显著变化，灰度值分析为Normal组的94.33%±4.86%；与Control组比较，GCase shRNA组中T-soluble α-syn蛋白水平有显著增加，灰度值分析为Control组的132.0%±6.26%。而给予Leu处理后T-soluble α-syn蛋白水平，较GCase shRNA组显著升高，灰度值分析为Control组的152.7%±6.323%。Western blotting检测T-insoluble α-syn结果表明：与Normal组相比较， Control组的T-insoluble α-syn蛋白水平无显著变化，灰度值分析为Normal组的99.75%±5.12%。与Control组比较，GCase shRNA组中T-insoluble α-syn蛋白有显著增加，灰度值分析为Control组的298.3%±15.82%。而给予Leu处理后T-insoluble α-syn蛋白水平，较GCase干扰组有显著下降，灰度值分析为Control组的211.5%±15.01%。结论：1、RNA干扰GCase后α-syn蛋白水平升高，但α-syn的mRNA水平无显著变化，表明RNA干扰GCase并不影响α-syn的转录水平。给予溶酶体抑制剂Leu处理，SH-SY5Y细胞中α-syn蛋白水平升高，而GCase是一种溶酶体酶，在RNA干扰后其酶活性下降，故认为α–syn蛋白水平变化的可能机制是GCase活性下调后影响溶酶体降解途径，引起α–syn堆积。2、 GCase干扰主要升高T-insoluble α–syn，而溶酶体抑制剂Leu处理主要升高T-soluble α–syn。故认为GCase干扰可能存在其他机制，引起α-syn发生聚集，产生不溶性的α-syn。第三部分GluCer对α-突触核蛋白淀粉样纤维化的影响目的：研究GluCer对α-syn淀粉样纤维化的影响，以期进一步阐明RNA干扰GCase影响α-syn的可能机制。方法：正常SH-SY5Y细胞中加入GluCer共培养，实验分3个组，对照组(Control)、GluCer低水平组(PC90/GluCer10)、GluCer高水平组(PC25/GluCer75)，对照组为正常培养细胞，余2个组分别按照相应比例加入L-α-卵磷脂(PC)和GluCer，在共培养24h和72h采用Western blot观察T-insoluble α-syn的表达情况。体外无细胞环境GluCer与α-syn共培育，模拟体内溶酶体环境(pH=5，37℃)，实验组设置情况同上，对照组只含有α-syn，余2个GluCer组除了等摩尔的α-syn外，分别按照相应比例加入PC和GluCer。在相应时间点，采用硫黄素T荧光性检测和刚果红吸光度分析，测定各组中α-syn蛋白淀粉样纤维化的情况。采用SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色检测蛋白质分子量改变情况。结果：SH-SY5Y细胞中加入GluCer共培养，Western blot结果：培养24h和72h，3个组T-insoluble α-syn表达水平无显著差异。体外无细胞环境GluCer与α-syn共培育，硫黄素T荧光性检测结果：与Control组比较，PC90/GluCer10组各时间点硫黄素T荧光度值均无显著变化；与Control组和PC90/GluCer10组比较，PC25/GluCer75组中硫黄素T荧光强度在16h时显著降低，24h时荧光强度显著升高，荧光强度升高具有滞后现象。刚果红吸光度分析结果与硫黄素T相似：与Control组比较，PC90/GluCer10组各时间点刚果红吸光度值均无显著变化；与Control组和PC90/GluCer10组比较，PC25/GluCer75组的刚果红吸光度值，在16h时显著降低，24h时吸光度显著升高，吸光度升高也具有滞后现象。SDS/PAGE凝胶电泳及考马斯亮兰染色结果表明，α–syn蛋白条带出现在35-50kD范围，从分子量上看符合不溶性α–syn的特征。结论：在体外无细胞环境中，GluCer可以加速α-syn的纤维化，引起α-syn分子量增大，并发生淀粉样纤维化；α-syn的变化情况与GluCer浓度相关。结论1.构建的3个GCase siRNA，瞬时转染均能达到干扰效果，经筛选siRNA1(1452)具有较好的干扰效果。2. siRNA1(1452)构建shRNA，进行慢病毒包装后能稳定感染SH-SY5Y细胞，经鉴定能稳定有效的干扰GCase mRNA的表达，下调GCase的表达。GCase水平下调后GCase酶活性下降，引起代谢底物GluCer分解减少，细胞内GluCer积累，7d内细胞存活及生长能力受到不同程度的影响。3. RNA干扰GCase后α-syn蛋白水平升高，但α-syn的mRNA水平无显著变化，表明RNA干扰GCase并不影响α-syn的转录水平。给予溶酶体抑制剂Leu处理，SH-SY5Y细胞中α-syn蛋白水平升高，而GCase是一种溶酶体酶，在RNA干扰后其酶活性下降，故认为α–syn蛋白水平变化的可能机制是GCase活性下调后影响溶酶体降解途径，引起α–syn堆积。提示：调节蛋白质的溶酶体降解途径可能是帕金森病的治疗靶点。4. GCase干扰主要升高T-insoluble α–syn，而溶酶体抑制剂Leu处理主要升高T-soluble α–syn。故认为GCase干扰可能存在其他机制，引起α-syn发生聚集，产生不溶性的α-syn。提示：改变细胞脂类构成可能是帕金森病的治疗靶点。5. GluCer和α-syn在体外无细胞环境中共培育，可以引起α-syn淀粉样纤维化，SDS/PAGE检测淀粉样的α-syn符合不溶性α–syn的分子量。故认为GCase干扰后，GluCer累积，可能通过改变细胞脂类构成，引起α-syn形成不溶性α-syn。