研究背景和目的结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是威胁人类健康的主要恶性肿瘤之一。我国属结直肠癌传统低发国家,但发病率近年上升明显,正以每年4%的速度递增,超出全球年均增长速度约2个百分点。结直肠癌已成为严重威胁我国居民健康和生命的重要疾病之一。结直肠癌的发生发展是环境因素与遗传因素共同作用下的多阶段、多步骤的过程。传统的流行病学研究普遍关注环境因素与结直肠癌的关联,而随着生物信息学、基因组学、转录组学等学科的迅猛发展,寻找敏感、特异的生物标志物用于发病风险评估和预测的研究方兴未艾。基因的遗传变异,可通过影响基因结构而影响其功能,从而在环境因素的作用下发挥不同的效应,导致个体结直肠癌易感性发生改变。通过以往的候选基因关联研究、全基因组关联分析以及二代测序等高通量研究,已发现不少与结直肠癌发生相关的单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphism,SNP),为深入研究结直肠癌发生的生物学机制提供了线索。miRNA作为一种非编码RNA,可以通过降解或抑制mRNA的翻译来发挥其对基因表达的调控作用,从而促进或抑制结直肠癌的发生和发展。基因芯片技术或qRT-PCR可完成外周血miRNA表达量的测定,从而评估miRNA作为新型结直肠癌风险评估标志物的可能性。由于外周血SNP和miRNA具有相对稳定、创伤性小、易于检测等特点,作为结直肠癌的分子标志物具有巨大的应用前景。因此,本研究通过在浙江现场联合采用自然人群和医院为基础的病例对照研究设计,明确与结直肠癌相关的SNP和miRNA,并联合环境因素,尝试构建适合我国汉族人群的结直肠癌风险评估模型,从而为制定预防和控制结直肠癌的策略提供依据。第一部分结直肠癌相关SNP标志物的筛选及风险评估模型的初步构建材料和方法以浙江省嘉善县为现场,采用以自然人群为基础的病例对照研究设计,纳入1990年5月至2016年5月发生的原发性结直肠癌存活病例1002例,以及年龄±5岁、性别、居住地匹配的同期999例正常个体作为对照。采用面对面访谈收集研究对象的一般特征和生活方式信息,同时抽取静脉血5ml。SNP的筛选结合GWAS Catalog数据库以及以往报道的Meta分析和综述,选择在亚洲人群或中国人群中与结直肠癌相关的候选SNP位点60个。采用Sequenom平台的MassARRAY技术对SNP位点进行基因分型。统计分析过程主要采用了 SAS 9.2和SPSS 22.0软件。根据阳性SNP等位基因数量,采用简单相加遗传风险评分(SC-GRS)和以OR值为权重的遗传风险评分(OR-GRS)分析多个SNP位点的联合作用与结直肠癌的关联。采用隶属函数数量化方法构建结直肠癌风险评估模型,并用ROC曲线下面积和H-L检验分别评估模型的区分度和校准度。结果经基因检测分型后,剔除检测失败位点和不符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律的SNP位点,最终纳入50个位点进行分析。经多因素logistic回归显示,在加性模型下,CCND2-AS1 rs10774214、COLCA1/COLCA2 rs3802842、8q24.21 rs11986220、ERCC5rs17655(ORrs10774214=1.24,95%CI:1.08-1.42;ORrs3802842=1.18,95%CI:1.04-1.35;ORrs11986220=1.20,95%CI:1.00-1.46;ORrs17655=1.16,95%CI:1.02-1.32)能够增加结直肠癌的风险,CYP1A1rs17861109能够降低结直肠癌的风险(OR=0.85,95%CI:0.74-0.97)。在共显性模型下,与 SMAD7rs12953717 CC 基因型携带者相比,CT基因型携带者发生结直肠癌风险升高了 23%(95%CI:2%-49%)。在隐性模型下,NQO1 rs1800566突变纯合性基因型TT对结直肠癌具有保护效应(OR=0.78,95%CI:0.63-0.98);CTLA4 rs231775 AA 基因型(OR=1.41,95%CI:1.04-1.91)和 SMAD7rs76886865 AA 基因型(OR=1.80,95%CI:1.11-2.90)能够增加结直肠癌的风险。遗传风险评分与结直肠癌的关联呈现着剂量反应关系,SC-GRS每增加1分,结直肠癌的发病风险升高为1.21(95%CI:1.14-1.28)倍;OR-GRS每增加0.1分,结直肠癌的发病风险升高为1.11(95%CI:1.08-1.14)倍。本研究初步构建了包含年龄、婚姻状况、饮茶、家族癌症史和OR-GRS在内的结直肠癌风险评估模型(模型1),ROC曲线下面积为0.605(95%CI:0.579-0.631),H-L检验的P值为0.122。第二部分结直肠癌相关血浆miRNA标志物的筛选及风险评估模型的构建材料和方法血浆miRNA的筛选采用发现阶段-内部验证阶段-外部验证阶段的研究思路,纳入2015年7月至2017年9月在浙江大学附属绍兴医院肛肠科行结直肠癌根治术的结直肠癌病例作为病例组,将同期嘉善县结直肠癌筛查队列中年龄和性别匹配的正常个体作为对照组。在56例结直肠癌病例和16例对照的血浆中,通过混样设计,采用AgilentHumanmiRNA芯片发现与结直肠癌相关的候选miRNA;再对同一样本进行个体水平的内部验证,采用qRT-PCR技术对候选miRNA进行检测;最后在300对病例和对照的血浆中,对内部验证出的miRNA进行qRT-PCR检测,筛选与结直肠癌相关的miRNA。采用面对面访谈收集研究对象的一般特征和生活方式信息,同时抽取静脉血5ml并分离出血浆。本研究统计分析过程主要采用了 SAS9.2、R3.4.3、SPSS 22.0和GraphPad Prism 5.0软件。在评价模型的区分度和校准度的同时,采用重分类改善指标和综合判别改善指标对不同模型进行效能上的比较。结果经miRNA芯片初筛和内部验证后,hsa-miR-16-5p和hsa-miR-451a在300对结直肠癌病例和对照的血浆中被外部验证。qRT-PCR检测结果显示,hsa-miR-16-5p(P=0.026)和hsa-miR-451a(P=0.028)在结直肠癌病例中的表达水平高于正常人,分层分析发现hsa-miR-16-5p和hsa-miR-451a在Ⅱ期和年龄≥65岁的结直肠癌病例中的表达水平高于正常人。采用外部验证样本对第一部分的模型1进行验证,ROC曲线下面积为0.614(95%CI:0.563-0.665),说明模型1较为稳定。本研究在模型1的基础上,进一步联合miRNA,构建了结直肠癌风险评估模型(模型2),ROC曲线下面积为0.654(95%CI:0.605-0.704),H-L检验的P值为0.005。与模型1相比,重分类改善指标和综合判别改善指标分别为0.319(95%CI:0.172-0.467)和 0.029(95%CI:0.018-0.041)。结论本研究采用生物信息学分析与人群研究相结合,筛选与结直肠癌相关的SNP和miRNA,并联合环境因素,构建结直肠癌风险评估模型,主要结论如下:(1)SNP 位点 rs10774214、rs12953717、rs1800566、rs3802842、rs11986220、rs17655、rs17861109、rs231775、rs76886865 与结直肠癌的发生相关;(2)hsa-miR-16-5p和hsa-miR-451a在结直肠癌患者的血浆中高表达;(3)联合环境和遗传因素的结直肠癌风险评估模型1的区分度和校准度较好,经另一样本验证后发现模型较为稳定;(4)联合环境、SNP和miRNA的结直肠癌风险评估模型2的判别效果更优。本研究识别出的结直肠癌相关的分子标志物可以为模型的建立奠定科学基础,但具体的分子机制仍有待验证。在进行模型的评估时,由于样本的选择采用了年龄和性别匹配的设计,可能会低估模型的效能。本研究构建的模型其外推和应用存在一定的局限性,有待基于自然人群的大规模前瞻性队列进行进一步验证和完善。