目的胆道闭锁(biliary atresia,BA)是婴儿早期累及肝内外胆道,最终导致终末期肝硬化的严重肝脏疾病,其特点为胆管进行性的炎症、梗阻、纤维化,并最终消失,即使在胆道重建术后大多数患儿的肝脏病变也将继续进展,最终约有80%的患者需肝移植。已有研究证明上皮间充质转化(epithelium-mesenchymaltransition,EMT)在多种组织器官的纤维化进程中发挥重要作用,其中伴随着胚胎发育相关基因的重新激活。因此本研究结扎幼鼠肝外胆道模拟新生儿胆道闭锁肝纤维化,探讨这一病理过程的相关分子在胆道闭锁肝纤维化过程中发挥的作用。材料与方法一、动物模型的建立选用100只3周Wistar大白鼠幼鼠,体重30-40g,健康,无明显畸形者。随机平均分成两组,一组(50只)实施BDL术(近肝门端胆总管双重结扎,结扎线之间离断),另一组(50只)作为对照组实施假手术(开腹游离胆总管不结扎)。术后相同条件下饲养。二、取材分别于术后3d、7d、14d、21d、28d处死幼鼠,分离取出完整肝脏,统一取同一肝叶作为标本,一部分固定于4%多聚甲醛留作免疫组化,另一部分冷冻于-80度留作RT-PCR。三、指标检测通过RT-PCR检测各目的基因:炎症相关因子TGF-β1,纤维化早期指标:COL1,胆管上皮细胞特异性细胞因子CK19,纤维化指标α-SMA等mRNA表达水平。结果一、大体肝脏病理结果BDL组:实验组幼鼠第二天开始排黄色尿;三天后可见近肝门处较小肝叶出现水样变性;7天肝脏标本可见水样变性范围扩大,在此基础上伴有黄色脂肪变性;14天肝脏可见水样变性消失,脂肪变性范围进一步扩大至较大肝叶;21天脂肪变消失,而肝脏表面出现均匀黄色小粟粒样结节;28天可见肝脏整体体积缩小,颜色加深变黄,可见更为显著的黄色粟粒样结节。对照组:肝脏标本各肝叶始终色泽红润,表面光滑,并随着幼鼠发育逐渐增大。二、RT-PCR结果在假手术对照组和BDL组幼鼠肝脏中均能检测出目的基因的表达。可见对照组目的基因mRNA扩增条带表达较弱,在BDL组表达增强,并且随着结扎天数的增加条带亮度逐渐增强,尤其TGF-β1及COL1目的条带增加趋势明显,对照组则未见明显变化趋势。统计分析显示两组TGF-β1及COL1的表达差异从3天开始有统计学意义,BDL组与对照组中CK19目的基因在第21天、28天表达的差异有统计学意义,α-SMA的表达则从第7天开始有统计学意义。对BDL不同天数组间的表达研究发现CK19在3-7天,7-14天,α-SMA在3-7天无统计学意义,而其他各组均有统计学意义,各目的基因组间表达呈增长趋势,其中14天-21天增长速度最快,这种趋势在α-SMA的表达中尤为明显。结论通过肝外胆道结扎造成胆道梗阻的幼鼠,肝脏呈现胆汁淤积性、进行性加重的纤维化表现。本实验研究发现BDL组肝脏纤维化相关基因表达明显高于对照组,并且随着梗阻天数的增加表达量明显增加。并且本实验还发现在肝纤维化过程中的14-21天是纤维化发生的特殊时期,这一时期可能是胆管上皮发生EMT的关键时期。在肝脏发生纤维化过程中,由于COL1表达增强早于α-SMA,所以COL1可以做为监测纤维化的早期指标。在BDL导致肝纤维化过程中,炎症相关因子TGF-β1可能发挥重要作用。