Exendin-4与其类似物GLP-1相同，具有血糖浓度依赖性的降血糖功能，是一种用于治疗Ⅱ型糖尿病的小肽药物。本课题围绕毕赤酵母细胞高效分泌表达exendin-4类物EXA，对表达载体的构建进行了较系统的研究，构建了一系列能有效分泌表达EXA的重组细胞，得到了能被GLP-1抗体识别的重组蛋白，为进一步高效表达EXA，开发Ⅱ型糖尿病药物积累了宝贵的材料和经验。 在分析比较exendin-4与GLP-1蛋白结构的基础上，将exendin-4的第14位甲硫氨酸突变为缬氨酸，按照毕赤酵母密码子偏爱性合成了exa基因和四拷贝exa基因串联体，以pPIC9K为起始表达载体，研究了基因拷贝数、串联方式、间隔肽以及蛋白糖基化修饰等载体构建策略对重组菌分泌目的蛋白的影响。 研究结果表明，多拷贝基因串联有利于EXA的分泌表达。以甲硫氨酸连接多拷贝EXA时，pPIC9K原有的分泌前导序列不能使4-EXA有效分泌到胞外，在引入糖基化短肽NTT和间隔肽NTTEEGEPK后，4-EXA(糖基化融合蛋白)表达水平达到了48mg/L。与之不同，如以肠激酶识别序列DDDDK作为多拷贝EXA之间的连接肽时，DDDDK直接插入pPIC9K分泌前导序列，就可实现重组蛋白的分泌表达，只在5拷贝EXA(35KDa)表达时发现较明显的胞内滞留。融合蛋白分泌表达水平与分子量成正相关，5-EXA分泌量达到80mg/L。但各拷贝数融合蛋白的分子量均比预测值偏大，极有可能是前导序列切割不完全所致。 载体构建策略不仅决定重组蛋白的分泌表达水平，还影响蛋白稳定性。在以肠激酶识别序列连接多拷贝EXA时，重组蛋白在纯化过程中产生严重降解，即使经离子交换和亲和层析，仍不能去除可能存在的蛋白酶，抑制目的蛋白的降解。