论文部分内容阅读
幽门螺杆菌是一种螺旋状、微需氧的革兰氏阴性菌，被世界卫生组织列为I类致癌因子。研究证实Hp是慢性胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡的主要致病因子，也是胃腺癌与胃淋巴瘤的诱发因素之一，可能在部分特发性血小板减少性紫癜(ITP)和其它一些自身免疫病的发病中起重要作用。全世界成年人口约50%携带该菌，幽门螺杆菌可以产生大量的尿素酶，该尿素酶对细菌在体内的定植及致病发挥着重要作用，已证实尿素酶B亚单位(UreB)是幽门螺杆菌的一个重要保护性抗原，研究共分三部分完成：采用PCR方法扩增Hp UreB基因，经双酶切构建表达载体pET28a-UreB，扩增出的Hp UreB基因序列与GenBank公布的26695标准株序列相比较核苷酸序列同源性达到96.73%，氨基酸序列同源性高达99.30%，表达载体导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞内，经过IPTG诱导进行表达，SDS-PAGE分析发现表达的重组蛋白相对分子质量约为66kDa，以可溶性形式存在。用纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠，ELISA检测血清抗体效价，与感染患者血清进行Western-blot鉴定。Western-blot结果显示重组UreB能被Hp感染患者血清特异性识别。同时，用纯化后的UreB蛋白免疫小鼠能诱导产生特异性体液免疫应答，具有很好的免疫原性，表达出具有生物活性的UreB蛋白。初步纯化的重组幽门螺杆菌UreB免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备抗UreB的单克隆抗体，筛选阳性细胞株，采用间接ELISA检测细胞特异性、细胞株培养上清和腹水抗体效价，并对其进行亚型鉴定和杂交瘤细胞株稳定性分析。经细胞融合及筛选克隆获得了9株能稳定分泌抗UreB单抗的杂交瘤细胞株，9株单抗与其他肠道细菌均无交叉反应，单克隆抗体亚类为IgG1、IgG2a、IgG2b，SDS-PAGE显示9株单抗的纯化后的单抗主要有两条蛋白区带，重链分子量约50kDa，轻链分子量约为25kDa。抗体效价分别为1:1280~1:5120，腹水抗体效价分别可达1:2.6×103~1:5.1×106，杂交瘤细胞经反复冻存、复苏及多次传代，仍能稳定分泌高效价抗体。以单克隆抗体6H4为捕获抗体、6F11-HRP为检测抗体建立Hp双抗体夹心ELISA检测方法，检测49例因上消化道症状接受检查的患者的幽门螺杆菌粪便。对每例患者同时进行14C-UBT作为Hp感染阳性诊断标准，对建立的双抗夹心法进行评价。结果显示14C-UBT诊断阳性31例,阴性18例。14C-UBT阳性的31例中双抗夹心法检测阳性29例,阴性2例，14C-UBT阴性18例;阴性的18例中双抗夹心法检测阴性18例。与14C-UBT法比较,Hp UreB双抗夹心检测法有较高的敏感性和特异性,是一种简便可靠,非侵入性的诊断Hp感染的方法,适合作为Hp感染的常规检查项目。