[目的]1.对比观察强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis, AS)患者竖脊肌与多发性肌炎(polymyositis, PM)肌肉对不同炎性标记物(CD4、CD8、CD20、CD68、 MHC-I)的表达强度,并探索AS肌肉炎性浸润细胞的种类。2.对AS肌肉中不同炎性标记物的敏感性比较,分析其各标记物之间相关性。[材料与方法]1.资料收集1.1资料来源10例AS患者中,6例患者来源于南方医院门诊,另外4例AS患者来源于南方医科大学中西医结合医院,其中：男8例,女2例,年龄20～28岁,病程4±0.6年；10例PM患者来源于南方医院神经内科住院部,其中：男3例,女7例,年龄42～50岁,病程2±0.4年；10例腰椎间盘突出(lumbar intervertebral disc protrusion, LIDP)患者作为阴性对照组,来源于广州市正骨医院脊柱科,其中：男7例,女3例,年龄51～60岁,病程6±1.2年1.2纳入标准1.2.1AS患者纳入标准(五项都具备者)：(1)符合1984年修订纽约诊断标准的AS患者；(2)大于15岁者,男女不限：(3)腰椎活动受限；(4)X线：骶髂关节硬化或髂骨面出现毛刺样变的患者；(5)血沉、C反应蛋白及疼痛评分均提示急性炎症反应期的AS患者。1.2.2PM患者纳入标准：诊断依据Bohan和Peter(1975年)提出的多发性肌炎/皮肌炎的诊断标准：(1)对称性、进行性近端肌无力；(2)肌活检示肌肉坏死、再生、炎症等改变,伴或不伴有肌萎缩；(3)血清肌酶(CK和醛缩酶)升高；(4)肌电图为肌源性损害；(5)如仍不能确诊者,活检后给予免疫抑制剂试验性治疗,取得满意疗效者,仍归于本组研究。1.2.3LIDP患者纳入标准：所有研究对象均为CT、MRI显示腰椎间盘突出病人,同时符合以下条件：(1)需要手术治疗者；(2)实验室检查血沉、类风湿因子、抗“O”正常。1.3排除标准1.3.1AS患者排除标准(有任何一项者)：(1)年龄小于15岁的患者；妊娠或哺乳期的患者；体弱不能耐受局部肌肉活检的患者；(2)合并严重的心脑血管等基础疾病的患者,精神疾病患者,肝肾功能严重异常的患者或者局部有明显皮损的患者；(3)不愿意签署有创活检知情同意书的患者1.3.2PM患者排除标准：(1)活检后仍不能确诊者,给予免疫抑制剂试验性治疗后,无明显效果者排除；(2)此外,伴有肿瘤、重叠综合征的PM不纳入本实验研究；(3)使用免疫治疗超过4周者不纳入研究。1.3.3LIDP患者排除标准：有明显心、脑、肝、肾重要脏器疾病史。2.肌肉标本收集及固定2.1标本收集2.1.1AS患者标本收集先对AS患者腰背肌触诊,选取肌肉变硬部位(L3/4),采用开放术式进行活检,局部消毒后,用2%利多卡因作皮下浸润麻醉至肌筋膜外(注意药物只到皮下组织不达肌肉,以免引起肌纤维肿胀而影响病理检查结果,可采用左手捏起皮肤,右手单手注射局麻药)。纵行切开皮肤约2-3cm,切开并分离皮下组织直达肌膜,切开肌膜,取约3×5×10mmm3肌肉一块。逐层缝合组织,用碘伏擦洗伤口,百多邦软膏涂擦缝合处,消毒纱布覆盖,1周后伤口愈合,拆线。所取肌肉活检组织经异戊烷—液氮速冻后,在-80℃USAULT1786-4-V41型低温冰箱保存。2.1.2PM患者的肌肉标本选取上肢肱二头肌,其余方法同AS患者；2.1.3LIDP患者标本在手术开始时,主刀医生选取手术区域竖脊肌。2.2标本的切片及染色将已经保存在低温冰箱的标本用Germany Leica CM1850切片机,作厚4um的恒冷冰冻连续切片,约200张,将切片分成两部分,第一部分进行苏木素—伊红染色(HE染色)；第二部分进行CD4、CD8、CD20、 CD68、MHC-I等炎性标记物ABC法免疫组化染色,将各组切片进行标记。2.2.1HE染色：经苏木精液染色,流水稍洗去苏木精液,经1%盐酸乙醇分化后,稍水洗,0.5%伊红液染色,蒸馏水稍洗,经各种浓度乙醇脱水：80%乙醇稍洗,90%乙醇Ⅰ,90%乙醇Ⅱ,95%乙醇Ⅰ,95%乙醇Ⅱ,无水乙醇,最后二甲苯透明后中性树脂封固。2.2.2ABC免疫组化染色：冰丙酮固定5min,经4%H2O2,正常山羊血清封闭；加一抗,4℃冰箱过夜。滴加适量生物素化二抗工作液,常温孵育30min,PBS洗两遍,滴加ABC复合物30min,最后DAB显色、苏木精复染、封固。利用LIDP组作为阴性对照组,用PM组作为阳性对照组。用正常PBS液代替一抗,作为一抗试剂本身阴性对照组。3.图片采集和分析利用显微摄影在固定光强度下摄像,每张切片随即选取10个观察视野摄像。运用Image pro-plus6.0图像分析软件对每张图像中10个视野测量其阳性表达区的Area (总面积)、max Density (最大光密度)、IOD(总面积×平均光密度)。经计算四个指标中Area结果等同于IOD, IOD最具有阳性区域表达的指标,且IOD指标同时包含Density和Area信息,故选取IOD作为评价指标。4统计学处理数据运用SPSS13.0软件处理,对AS与PM两组中其余抗体、AS与LIDP两组的所有IOD值,以及AS组的四种抗体的敏感性比较,均利用one-way ANOVA分析,两两比较方差齐用LSD法,不齐用Dunnett’s T3法。均以双侧P<0.05为存在显著性差异表示有统计学意义。[结果]1.分析前期,经2位病理学专家观察,各组染色结果,三组中CD20均未见明显阳性表达,故对CD20未加入对照研究过程。2.HE染色结果：AS组中可见散在肌纤维内出现中心核；同时,炎细胞浸润处肌细胞纤维化,其内可见单核细胞聚集,并见细胞膜破裂；出现纤维化组织被外层巨噬细胞所吞噬迹象。炎性细胞浸润附近肌束大小不等、部分肌纤维萎缩；PM组中：主要表现不同程度灶性或节段性肌纤维坏死、炎细胞浸润和肌纤维再生,肌纤维坏死程度一般较重,呈散在、灶性分布在肌束内；炎性细胞主要浸润于肌内膜；肌细胞严重萎缩；LIDP组：肌肉组织细胞大小一致,呈多角形相嵌分布,未见炎细胞浸润、肌纤维坏死及再生等变化。3.IOD指标比较结果：AS与LIDP组三种抗体(CD、CD8、CD68、MHC-I)的IOD有显著性差异(P<0.05),根据平均值判断,AS组各种炎性表达均强于LIDP组；AS与PM比较：CD8、MHC-I抗体的IOD在两组中均无显著性差异(均P>0.05)；CD4、CD68抗体IOD在两组中均有显著性差异(均P<0.05),根据IOD平均值判断：PM组炎性表达强于AS组。4.敏感度比较结果：在AS组中,四种抗体之间的敏感性统计学有显著性差异(F=70.144,P<0.05),根据平均值判断：各抗体敏感性由高到低依次为：MHC-Ⅰ、CD4、CD68、CD8。5.免疫组化结果：AS组：被炎性细胞浸润的血管区域出现CD4、CD8弱阳性表达,且CD4强于CD8。CD4、CD68在局灶炎性细胞及纤维化的肌组织中均有表达,而其周围正常肌细胞未见阳性表达。CD68与MHC-Ⅰ在细胞膜呈强阳性表达,同时MHC-Ⅰ在炎性细胞胞浆中、炎性细胞及其周围血管内膜出现阳性表达出现阳性表达。PM组：四种标记物均有表达且呈强阳性表达,对CD68染色最为敏感。[结论]无论在AS组还是PM都存在肌细胞被炎性细胞浸润现象,AS以单核巨噬细胞浸润为主,各种炎症标记物阳性表达明显强于正常肌细胞,但低于PM。而PM以淋巴细胞浸润为主,炎症主要侵犯肌细胞周围的血管等结缔组织。虽然PM组和AS组均出现肌细胞大小不等表现,但PM面积较AS组范围更广,强度更强。MHC-Ⅰ在AS的肌细胞胞浆内表达是与其他四种标记物的最大区别之处。