由RAF激酶介导的RAS/RAF/MEK/ERK通路在肿瘤的发生、发展与转移中发挥着重要的作用,到目前为止得到广泛的研究。该通路中的关键性激酶RAF,可以通过依赖或者不依赖RAS激酶的方式来产生信号传导作用。鉴于此,RAF激酶抑制剂已成为当前抗肿瘤药物研究的热点。本文以1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶环为铰链结合区模板设计、合成系列新的化合物,评价化合物的激酶抑制活性、体外抗细胞增殖活性,研究体外抗肿瘤作用分子机理,为发现活性更高,结构更新颖的的广谱RAF激酶抑制剂提供实验依据。主要研究工作和结果:1.鉴于1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶核的结构与嘌呤的结构类似,可以通过氢键与铰链区的ATP结合口袋结合,可作为激酶铰链结合区模板。为了发现有效的RAF激酶抑制剂,我们以Sorafenib为先导化合物,用1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶环代替吡啶环设计出化合物1a,分子对接显示1a能与激酶的活性口袋进行很好的结合。以4,6-二氯-5-嘧啶甲醛为原料,经成环、1-NH四氢吡喃保护、4-苯氧基取代、与芳基异氰酸酯缩合反应、脱保护等反应合成1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶衍生物(1a-1t),以4,6-二氯-5-嘧啶甲醛为原料,经成环、1-NH甲基化、4-苯氧基取代、芳基异氰酸酯缩合反应等反应合成1-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶衍生物(1u-1v),共22个目标化合物。2.我们对上述合成的目标化合物进行了 BRAFV600E激酶活性测试,有12个化合物在1 μM浓度下对BRAFV600E的抑制率大于60%,其中1v对BRAFV600E的抑制活性优于Sorafenib,其IC50值为23.6nM。细胞抗增殖实验显示大部分化合物对肿瘤细胞(A375、HT-29、PC-3、A549)表现出较强的抗增殖活性,且对正常细胞(MDCK)毒性较小。3.激酶选择性实验表明,1v不仅对BRAFV600E有很好的抑制活性,还对BRAF(wt)(IC50 = 51.5 nM)和CRAF(IC50 = 8.5 nM)表现出较强的抑制活性。此外,.对其它13种激酶几乎无抑制活性(抑制率<30%),结果显示1v是具有选择性的pan-RAF激酶抑制剂。4.细胞划痕实验表明,1v能抑制A375细胞的迁移能力,且呈浓度依赖性。细胞周期分析结果显示,1v可诱导A375细胞阻滞在G0/G1期,并将PC-3细胞阻滞在G2/M期。5.Western blot结果表明,1v能抑制RAF下游信号分子MEK的激活,下调了A375、HT-29细胞中MEK磷酸化蛋白的表达,并呈现出剂量依赖性。且能抑制A375细胞中周期调控蛋白cyclinD1的表达。6.我们对1v与BRAF复合物体系进行了分子动力学模拟和结合自由能分析。化合物1v与BRAFV600E的结合自由能为负值,说明化合物1v与BRAFV600E存在较强的作用,能量项的分解表明范德华力、静电作用和非极性溶剂化对1v与BRAFV600E的结合是有利的,而极性溶剂化能是不利于结合的。