急性肺泡低氧临床上比较常见。低氧诱导因子家族在低氧适应性反应中居于核心地位。目前的研究基本集中于HIF-1a，对其他两个成员mF-2 a和HIF-3a的研究较少，尤其在II型肺泡上皮细胞上。作为临床上最常用的静脉麻醉药，异丙酚有抗炎和抗氧化的特性，因此，①在第一部分探讨了低氧诱导因子家族及靶基因的动态变化；②在第二部分研究了异丙酚对低氧诱导因子家族、靶基因、细胞凋亡和细胞活力的影响；③在第三部分用RNAi技术探讨低氧诱导因子家族成员之间及低氧诱导因子家族一靶基因之间的作用机制；④在第四部分建立低氧性肺损伤动物模型，进一步确证低氧诱导因子家族的动态变化及异丙酚对其的影响。本实验有助于为异丙酚在低氧性肺损伤情况下的使用提供理论依据。 第一部分 低氧诱导因子家族及靶基因的动态变化 目的：研究低氧诱导因子及靶基因的动态变化。 方法：A549细胞分为两组，分别予以5％和1％低氧处理，在0、2、4、8、12五个时间点收集细胞，用Real Time PCR方法检测HIF-la、HIF-2a、HIF-3α、VEGF-A、Glutl、Bnip3L、β—Actin的mRNA表达水平。用Westem B10t方法检测HIF-lα、HIF-2α、HIF-3α的蛋白表达水平。 结果：急性低氧期HIF-1α仅mRNA的水平保持不变，随着低氧时间的延长，HIF-1αmRNA水平下降，HIF-lα的蛋白水平随时程呈现从增高到下降的过程。HIF-2α、HIF-3α mRNA和蛋白水平随着低氧时间的延长呈增高趋势。Bnip3L、Glutl的mRNA动态变化曲线和HIF-lα蛋白水平的动态变化曲线一致，VEGF-A的mRNA动态变化曲线和HIF-2α,蛋A水平的动态变化曲线一致。 结论：HIF-1α的蛋白水平随时程呈现从增高到下降的过程。HIF-2α、HIF-3α蛋白水平随着低氧时间的延长呈增高趋势。FHF-α家族的蛋白水平与转录调控有关。HIF-α家族通过对靶基因的调控体现了生物体的低氧适应性反应。 第二部分异丙酚对HIF-α家族及靶基因的影响 目的：研究异丙酚对A549细胞的低氧诱导因子家族、靶基因、细胞凋亡和细胞活力的影响。 方法：A549细胞分为三组，即正常氧组、5％低氧处理组和1％低氧处理组。各组在不同氧浓度处理前半小时分别给予Oug／ml、4ug／ml、10ug／ml、20ug／ml异丙酚(1ug／u1)处理，随后以不同的氧浓度处理4h，最后收集细胞，用Real Time PCR方法检测HIF—lα、HIF一2α、HIF-3α、VEGF-A、Glutl、Bnip3L、β-Actin的mRNA表达水平。用Western Blot方法检测HIF一1α、HIF-2α、HIF-3α的蛋白表达水平。用流式细胞仪检测细胞膜上Annexin V的表达水平。MTT法检测细胞活力。 结果：低氧状态下异丙酚剂量依赖性地抑制HIF-1α mRNA和蛋白表达及Bnip3L和Glutl mRNA表达。低氧状态下异丙酚能增加细胞活力，减少凋亡率。低氧状态下异丙酚对HIF-2α、HIF-3α mRNA和蛋白水平无影响，对VEGF-A的mRNA水平亦无影响。常氧状态下异丙酚对HIF-α家族和靶基因mRNA水平无影响，对细胞的活力和凋亡率也无影响。常氧状态下异丙酚剂量依赖性地抑制HIF-a的蛋白表达，而对HIF一2α、HIF一3α的蛋白水平无影响。 结论：通过HIF-α家族及靶基因的介导，异丙酚能减少低氧状态下A549细胞的凋亡，从而达到肺保护的效果。 第三部分 异丙酚和低氧对HIF-α家族及靶基因的作用机制探讨 目的：用RNAi技术探讨低氧诱导因子家族成员之间及低氧诱导因子家族一靶基因之间的作用机制 方法：A549细胞分为四组，即Control-siRNA组、HIF-1a-siRNA组、HIF-2a-siRNA组和Combination-siRNA组。Control-siRNA组用阴性对照siRNA载体干扰，HIF-lot-siRNA组用HIF-1a-siRNA载体干扰，HIF-2a-siRNA组用HIF-2a-siRNA载体干扰，Combination-siRNA组用HIF-la-siRNA载体和HIF-2a-siRNA载体联合干扰。各组又分为两个亚组，亚组1低氧处理前半小时不给予异丙酚处理，亚组2低氧处理前半小时给予10ug／ml异丙酚(10ug／ul)处理，随后1％氧浓度处理4h，最后收集细胞，用Real Time PCR方法检测HIF-1a、HIF-2C、HIF-3a、VEGF-A、Glutl、Bnip3L、β-Actin的mRNA表达水平。用Western Blot方法检测HIF-1a、HIF-2a、HIF-3a的蛋白表达水平。用流式细胞仪检测细胞膜上Annexin V的表达水平。MTT法检测细胞活力。 结果： 1．设计合成的HIF-1asiRNA和HIF-2asiRNA转录后基因沉默效果良好。 2．HIF-2a不影响HIF-1a mRNA和蛋白的表达，HIF-1a不影响mF-2a mRNA和蛋白的表达。HI-1a和HTF-2a均不影响HIF-3a的基因和蛋白质表达。 3．HIF-lα促进Glutl和Bnip3L转录，HIF-2α主要影响VEGF-A转录。 HIF-1α促进凋亡，降低细胞活力；HIF-2α抑制细胞凋亡，增加细胞活力。 4．异丙酚能抑制HIF-1α的mRNA和蛋白表达，不影响HIF-2α和HIF-3α的mRNA和蛋白表达。异丙酚抑制HIF-1α的靶基因表达，进而影响细胞凋亡和细胞活力。 结论： 1．HIF-2α和HIF-1α之间不存在相互调节，HIF-2α和HIF-1α对HTF-3α无调节作用。 2．HIF-1α的靶基因主要是Glutl和 Bnip3L，HIF-2a的靶基因主要是VEGF-A。 3．异丙酚能抑制HIF-1α及靶基因的表达，对A549细胞有保护作用。 第四部分异丙酚预处理对低氧性肺损伤的保护作用 目的：探讨异丙酚对低氧性肺损伤的保护作用及作用机制。 方法：将36只SD大鼠根据有无异丙酚预处理等分为两组：Propofol(一)组和Propof1(+)组，Propofol(一)组不给予异丙酚预处理，Propof1(+)组给予异丙酚预处理。每组根据低氧时间的长短分为三亚组。6亚组具体如下：Propofol(一)低氧Oh亚组，Propofol(-)低氧4h亚组，Propofol(一)低氧6h亚组，Propofol(+)低氧Oh亚组，Propofol(+)低氧4h亚组，Propofol(+)低氧6h亚组。实验结束后取材，透射电镜检查肺泡上皮细胞的形态学改变，用RealTime PCR方法检测HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α、VEGF—A、Glutl、Bnip3L、β-Actin的mRNA表达水平。用Western Blot方法检测HIF—lα、HIF一2α、HIF-3α的蛋白表达水平。 结果：透射电镜的观察说明随着低氧时程的延长肺泡上皮细胞的损伤逾加严重，而异丙酚能减轻低氧性肺损伤。低氧性肺损伤引起肺组织HIF-1αmRNA水平降低和HIF-1α蛋白水平的山峰状变化。低氧性肺损伤引起HIF-2α、HIF-3α mRNA的蛋白水平的增高。Bnip3L的Glutl的mRNA水平动态变化曲线和HIF一1α蛋白动态变化曲线相一致，VEGF—A mRNA水平动态变化曲线和ⅢHIF-2α蛋白动态变化曲线相一致。异丙酚能降低HIF一1αmRNA水平和HIF-1α蛋白水平，进而抑制Bnip3L和Glutl的转录。异丙酚对HIF-2α、HIF-3α mRNA和蛋白水平无影响，对HIF一2α的靶基因VEGF—A的转录也无影响。 结论：低氧性肺损伤引起HIF-α家族mRNA和蛋白的有规律动态变化，异丙酚能通过抑制HIF-1α而抑制凋亡和过度糖酵解，对低氧性肺损伤起保护作用。