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Bcr-Abl融合蛋白是慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)发病的重要因素。该蛋白只定位于细胞浆,通过激活抗凋亡信号显著抑制细胞凋亡,诱导细胞的恶性转化。因此,我们设想通过雷帕霉素类似物核转运系统(Rapamycin analog transport system, RATS)转运Bcr-Abl入核,利用Bcr-Abl组成性的激酶活性,诱导CML细胞的凋亡。本课题通过构建重组腺病毒Ad5-FL AG-3NLS-FRB*(Ad5-FN3R)、野生型Ad5-HA-2FKBP-ABD(Ad5-HF2A)和突变型Ad5-HA-2FKBP-ABD (Ad5-HF2ATM),共感染K562细胞,在加入雷帕霉素类似物AP21967后,检测目的蛋白FN3R、HF2A、 HF2ATM和Bcr-Abl的定位变化及其引起的细胞增殖、凋亡效应的改变,为后续实验奠定基础。采取的主要实验方法如下：1.重组腺病毒Ad5-FN3R、Ad5-HF2A、Ad5-HF2ATM和Ad5-null的构建与鉴定：将FLAG标记的三段NLS (FLAG-3NLS)与突变修饰的雷帕霉素靶FRB结构域(FRB*)通过重叠PCR拼接获得目的基因FLAG-3NLS-FRB*(FN3R),将其克隆入穿梭载体pAdTrack-CMV中。通过分步克隆,将HA、两段FKBP、ABD或ABDTM(突变了ABD上结合Abl的三个重要氨基酸)等4个片段依次克隆入pAdTrack-CMV中。经酶切和测序鉴定后,与腺病毒骨架质粒pAd5同源重组,在AD-293细胞中包装、扩增。PCR检测目的基因在腺病毒液中的表达。Western blot检测目的蛋白FN3R、HF2A和HF2ATM在AD-293细胞和K562细胞中的表达。2. RATS转运Bcr-Abl入核前后目的蛋白FN3R、HF2A、HF2ATM和Bcr-Abl的定位研究：将重组腺病毒Ad5-FN3R和Ad5-HF2A(或突变对照Ad5-HF2ATM)共感染K562细胞,在加入雷帕霉素类似物AP21967前后,免疫荧光检测目的蛋白FN3R、HF2A、HF2ATM和Bcr-Abl在K562细胞中的定位。3. RATS转运Bcr-Abl入核后对K562细胞增殖、凋亡相关效应的影响：将重组腺病毒Ad5-FN3R和Ad5-HF2A(或突变对照Ad5-HF2ATM)共感染K562细胞,在加入AP21967后,用MTS法检测细胞增殖；用瑞氏染色、DAPI染色和caspase3活性实验检测细胞凋亡。通过以上试验,得出以下结果和结论：1.成功构建了重组腺病毒Ad5-FN3R、Ad5-HF2A、Ad5-HF2ATM和Ad5-null, Western blot证实在AD-293细胞和K562细胞中成功表达出了目的蛋白。2. RATS成功转运Bcr-Abl入核,免疫荧光证实在加入AP21967前,FN3R主要定位于细胞核,HF2A和HF2ATM主要定位于细胞浆,Bcr-Abl定位于细胞浆；在加入AP21967后,FN3R和HF2A主要位于细胞核,而Bcr-Abl部分定位于细胞核；突变对照组FN3R和HF2ATM主要定位于细胞核,Bcr-Abl仍定位于细胞浆,与预期结果基本相符。3. RATS转运Bcr-Abl入核后,MTS结果显示K562细胞增殖明显降低,瑞氏染色、DAPI染色和caspase3活性检测证实K562细胞凋亡明显增加。