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枯草芽孢杆菌作为一种安全、高效、无污染的微生物制剂,具有抑制病原菌、分泌有益物质、净化水体、促进生长、提高免疫力和调节肠道微生物等多方面的作用。本实验室在前期研究中分离获得了一株枯草芽孢杆菌HAINUP40,相关实验表明该菌株对无乳链球菌有较强的拮抗作用,对罗非鱼的生长有较好的促进作用,且具有较好的净水效果,为了该菌株在生产上的应用,本研究对其发酵条件进行了优化,并建立了简易发酵方法,同时研究该菌株在饲料中以不同状态及添加浓度条件下,对罗非鱼生长、非特异免疫力和抗无乳链球菌侵染能力的影响,并筛选最优势投喂菌株。首先,本研究采用响应面法对枯草芽孢杆菌HAINUP40发酵工艺进行优化。结果表明,枯草芽孢杆菌分泌拮抗物质的优化条件为:糖蜜浓度为1.5%、氯化钾浓度为0.1%、大豆蛋白胨浓度为1%、pH为7.5、接种量为6%、摇床转速为100r/min、装液量为64.431mL、温度为37℃时,拮抗圈的大小为9.44mm,较之优化前提高了 46.8%;枯草芽孢杆菌分泌胞外蛋白酶的优化条件为:糖蜜浓度为1.5%、氯化钾浓度为0.1%、大豆蛋白胨浓度为1%、pH为7.5、接种量为6%、摇床转速为1OOr/min、装液量为66.657mL、温度为37℃时,蛋白酶圈的大小为12.198mm,较之优化前提高了 33.8%;枯草芽孢杆菌菌体生长的优化条件为:糖蜜浓度为1.5%、氯化钾浓度为0.1%、大豆蛋白胨浓度为1%、pH为7.5、接种量为6%、摇床转速为100r/min、装液量为62.69mL、温度为37℃时,菌落数为11.273 lg/mL,较之优化前提高了 8.1%。其次,考虑生产成本问题,根据上述发酵工艺条件,以糖蜜、豆粕粉、氯化钾为基础发酵培养基,以“充气”方式代替了摇床,为枯草芽孢杆菌提供充足的氧气环境,建立了 50L密封罐简易发酵培养方法,经过20小时的发酵,枯草芽孢杆菌HATNUP40的产物与实验审发酵在同一数量级上,为生产发酵和应用奠定了基础。最后,本研究对简易发酵获得的枯草芽孢杆菌HAINUP40,将其按照不同添加量拌料投喂罗非鱼,并比较了活菌和死菌对罗非鱼生长特性、非特异性免疫指标和抵抗无乳链球菌致病能力的影响,最终确定对生长有较好促进作用的菌株状态及浓度。枯草芽孢杆菌HAINUP40对罗非鱼生长性能的影响测定结果显示,添加枯草芽孢杆菌HAINUP40的各组罗非鱼的体重增长率均高于对照组,其中,W10组体重增长率和特定生长率有显著性提升(P<0.05);各HAINUP40投喂组罗非鱼的肝体比和脾脏指数与对照组无显著性差异(P>0.05)。枯草芽孢杆菌HAINUP40对罗非鱼非特异性免疫的影响测定结果显示:所有投喂HAINUP40的各组罗非鱼血清中溶菌酶(LZM)的含量均高于对照组,其中W10组、W8组、M10组和M6组中的溶菌酶含量显著性高于对照组(P<0.05);M10组、M8组和W8组总抗氧化能力(T-AOC)显著性提高(P<0.05);W8组和W6组中的总蛋白含量提升不显著(P>0.05);W10组、W8组、W6组、M8组和M6组中的酸性磷酸酶活性提升不显著(P>0.05);M10组、M6组、W8组、W6组与对照组无显著性差异(P>0.05)。在8周养殖结束后对7组罗非鱼采用腹腔注射的方式进行无乳链球菌攻毒实验,结果显示:各组罗非鱼在攻毒后第1-6天陆续出现死亡,第6天后罗非鱼状态趋于稳定且未见罗非鱼死亡,各HAINUP40投喂组罗非鱼死亡率均低于对照组(90%),其中,W10组的罗非鱼死亡率最低(35%)。综上所述,本文确定了枯草芽孢杆菌HAINUP40的适宜发酵条件,并建立该菌株的简易发酵工艺,同时,研究了该菌株在饲料中添加剂量和菌株状态对罗非鱼非特异性免疫指标及罗非鱼抗无乳链球菌侵染能力的影响,为该菌株在罗非鱼养殖生产中的应用奠定了基础。