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肝癌死亡率在常见肿瘤中位居第二位,由于早期诊断率较低,确诊时多数已发生局部侵袭及转移。肿瘤复发和转移是导致包括肝癌在内的恶性肿瘤患者死亡的主要原因。恶性肿瘤上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的形成是引起肿瘤侵袭和转移的关键环节。近年来的研究表明,在肿瘤进展过程中,肿瘤炎性微环境通过诱导上皮间质转化启动或推进肿瘤细胞侵袭和转移。炎性细胞因子IL-6介导的JAK/STAT3信号通路激活在慢性炎症促进EMT过程中起着关键作用。在临床及实验研究中,中医药对于预防肿瘤复发转移具有明显优势,中医药对肿瘤上皮间质转化的形成也发挥抑制作用,但目前尚缺乏其作用的分子机制研究。研究目的：探讨鳖甲煎丸化裁方抑制肝癌上皮间质转化的分子机制。研究方法：1.MTT法及Annexin V-FITC/PI法检测鳖甲煎丸化裁方各浓度含药血清对HCCLM3增殖和凋亡的影响。2.通过体外实验,建立IL-6诱导高转移潜能肝癌细胞系H CCLM3形成EMT的实验模型。观察IL-6诱导后HCCLLM3细胞形态的变化,Western Blot 及 qRT-PCR对EMT特征性蛋白(E-cadherin, N-cadherin以及Vimentin)进行定量分析。IL-6诱导EMT形成后,进一步对其作用的机制进行研究,应用JAK2/STAT3抑制剂JSI-124作为阳性对照,分别检测IL-6诱导后STAT3, p-STAT3, TWIST蛋白表达及mRNA表达量的变化。3.通过体外实验建立IL-6诱导高转移潜能肝癌细胞系HCCLM3形成EMT的实验模型,进一步检测鳖甲煎丸化裁方各浓度含药血清及JSI-124对EMT特征性蛋白(E-cadherin, N-cadherin 及 Vimentin), JAK2/STAT3/TWIST信号通路激活的关键蛋白(JAK2, p-JAK2, STAT3, p-STAT3, TWIS T)的表达量的影响。4.体内实验建立高转移潜能肝癌细胞系HCCLM3皮下移植瘤自发性肺转移模型,应用免疫组化,Western Blot & qRT-PCR分别检测各浓度鳖甲煎丸化裁方及JSI-124干预14d和21d后,对肿瘤组织中EMT(E-cadherin, N-cadherin 及 Vimentin)及 JAK2/STAT3/TWIST信号通路特征性蛋白(JAK2, p-JAK2, STAT3,p-STAT3, TWIST)进行定位及定量分析。5.Transwell口肺组织HE染色,分别检测各浓度鳖甲煎丸化裁方及JSI-124对肝癌细胞侵袭能力及肺转移的影响。研究结果：1. 鳖甲煎丸化裁方各浓度含药血清对HCCLM3细胞增殖的影响。结果显示,鳖甲煎丸化裁方各浓度含药血清在干预24h后,低,中剂量鳖甲煎丸化裁方含药血清组对细胞增殖的影响不大,与C ontrol组相比较,差异无统计学意义(P>0.05)。在各给药组干预48h后,中、高剂量鳖甲煎丸化裁方含药血清组的增殖率分别为87.86%和84.60%,与Control组相比较,对细胞的增值率影响具有统计学差异(P<0.05)。2.鳖甲煎丸化裁方各浓度含药血清对HCCLM3细胞凋亡的影响。结果显示,各给药组在干预24h后,鳖甲煎丸化裁方低剂量对细胞造成的凋亡与Control组相比较,无统计学差异rP>0.05),而中、高剂量及JSI-124(0.5μmol/l)的凋亡率分别为7.90%,12.22%和15.36%,具有统计学差异(P<0.05)。在各给药组在干预48h后,鳖甲煎丸化裁方低、中、高剂量及JSI-12405μmol/l的凋亡率分别为8.08%,11.95%,13.89%和19.02%,与Control组相比较差异具有统计学意义(P<0.05)。3. IL-6(100 ng/ml)诱导24h,48h均可以降低E-cadherin表达量，与 Control比较具有统计学差异(P<0.05)；同时也可以提高N-cadherin, Vimentin表达量,与Control比较具有统计学差异(P<0.01)。IL-6 (100 ng/ml)诱导48h后, STAT3磷酸化及TWIST表达水平增高。IL-6诱导的HCCLM3发生EMT,细胞的侵袭能力明显增强。4.体外实验中,IL-6+BJJH及IL-6+JSI-124组较IL-6+组,E-cadherin的表达升高,同时抑制N-cadherin 及 Vimentin蛋白的表达,差异有统计学意义(P<0.05)。体内实验中,各剂量鳖甲煎丸化裁方及JSI-124给药14d,21d后, BJJH及JSI-124组均能明显增加肿瘤组织中E-cadherin的表达,降低N-cadherin 用 Vimentin,与 Control组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。5. Transwell结果显示,IL-6+BJJM, IL-6+BJJH及IL-6+JSI-124(0.5μmol/l)的透膜细胞数明显少于IL-6+组,差异具有统计学意义(P<0.05)。肺组织HE染色显示：鳖甲煎丸化裁方随剂量增加及干预时间的延长,肺转移瘤数较对照组减少。6.体外实验中,IL-6+BJJH及IL-6+JSI-124组较IL-6+组, JAK2, STAT3, p-JAK2, p-STAT3及TWIST的表达显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。体内试验中,各剂量鳖甲煎丸化裁方给药14d,21d后,BJJH及JSI-124组均能明显降低肿瘤组织中IL-6R,JAK2, STAT3, TWIST表达降低以及抑制p-JAK2, p-STAT3磷酸化表达,与对照组相比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。研究结论：1.在体外实验中,鳖甲煎丸化裁方含药血清能够抑制HCCLM3细胞增殖并促进其凋亡,随剂量增加,鳖甲煎丸化裁方含药血清致使HCCLM3增殖率逐渐降低,而凋亡率逐渐升高。2.IL-6(100ng/ml)通过介导JAK2/STAT3/TWIST信号通路激活,进一步诱导HCCLM3发生上皮间质转化,从而增强HCCLM3细胞的侵袭能力。3.高剂量鳖甲煎丸化裁方抑制HCCLM3 EMT的形成,从而降低HCCLM3的侵袭及肺转移的能力。4.高剂量鳖甲煎丸化裁方通过抑制IL-6介导JAK2/STAT3/TWIST信号通路激活,进一步抑制：HCCLM3皮下移植瘤EMT的形成。鳖甲煎丸化裁方抑制AK2/STAT3/TWIST信号通路激活,可能是抑制肝癌复发转移的重要机制之一