论文部分内容阅读
目的:
研究氯化两面针碱对人口腔表皮样癌细胞多药耐药的逆转作用及其作用机制，为NC作为一种多药耐药逆转剂应用于临床肿瘤多药耐药提供依据。
方法:
1、体外细胞模型研究NC的耐药逆转活性。MTT法检测NC对6株多药耐细胞的抑制率，选取NC抑制率小于10％的浓度做为耐药逆转浓度;MTT法检测NC对6株细胞的耐药逆转的倍数，选取逆转作用效果最好的细胞用于后续研究;用药后HE染色观察细胞形态学变化，透射电镜观察细胞显微结构改变，AO/EB观察细胞凋亡形态，划痕实验和Transwell小室实验检测细胞的迁移侵袭能力，流式细胞仪检测细胞凋亡率。
2、体内动物模型研究NC的耐药逆转活性。裸鼠皮下接种多药耐药细胞，用药后记录瘤体体积变化，绘制瘤体生长曲线，HE染色观察瘤体组织形态学变化，透射电镜观察瘤体细胞显微结构改变，Hoechst33342染色观察细胞凋亡形态和，TUNEL染色观察瘤体组织细胞的凋亡指数;使用荧光素标记肿瘤细胞，显微注射接种至斑马鱼体内，建立斑马鱼移植瘤模型，荧光显微镜拍照分析用药后各组斑马鱼移植瘤荧光强度变化。
3、NC对多药耐药细胞的逆转活性与TopoⅡα的相关性研究，初步了解到NC多药耐药逆转作用的机制。采用计算机辅助药物设计软件将NC与TopoⅡα进行分子对接，在分子水平推测NC与TopoⅡα的结合和相互作用方式。采用TopoⅡα介导的DNA松弛实验和DNA嵌入实验，体外检测NC对TopoⅡα的抑制作用;RT-PCR分别检测细胞模型，裸鼠移植瘤模型和斑马鱼移植瘤模型中各组别TopoⅡα基因表达变化;Western Blot分别检测细胞模型，裸鼠移植瘤模型和斑马鱼移植瘤模型中各组别TopoⅡα蛋白的表达变化。
4、NC对TopoⅡα过表达细胞系的作用研究。采用慢病毒侵染方法构建TopoⅡα过表细胞系，MTT法检测过表达细胞系的生长曲线以及NC抑制率小于10％的浓度;用药后HE染色观察细胞形态学变化，Hoechst33342染色观察细胞凋亡，划痕实验和Transwell小室实验检测细胞的迁移侵袭能力，流式细胞仪检测细胞凋亡率，RT-PCR和Western Blot分别检测细胞内TopoⅡα基因与蛋白的表达变化。
5、NC耐药逆转过程中对PTEN/PI3K/AKT信号通路相关蛋白的影响。采用Western Blot检测NC耐药逆转过程中各组细胞的PTEN、PI3K、AKT、p-AKT和Caspase-3蛋白表达的变化，初步了解到NC耐药逆转过程PTEN/PI3K/AKT信号通路的变化。
结果:
1.体外细胞模型实验研究结果
MTT法测定NC耐药逆转浓度为1.5μg.mL-1;NC对6株多药耐药细胞的耐药逆转指数显示对KB/ADM细胞的耐药逆转作用最好;HE染色结显示VP16组细胞形态无明显变化，VP16联合VRP或NC组可观察到细胞数量减少，胞膜破损，核固缩等现象;透射电镜可观察到VP16组细胞形态完整，没有明显的凋亡现象，在VP16联合VRP或NC组观察到细胞皱缩，微绒毛结构减少甚至消失，胞浆空泡形成，核固缩，染色质浓集于核膜内侧等凋亡形态特征;与单独使用VP16比较，VP16联合VRP或NC组划痕愈合速度明显减慢，NC组可观察到部分细胞死亡;与单独使用VP16组细胞比较，VP16联合VRP或NC组细胞的透膜数明显减少;AO/EB染色实验中VP16组细胞形态较完整呈明亮的绿色荧光，VP16联合VRP或NC组细胞数量减少，细胞核皱缩，可观察到明显的橙红色荧光;流式细胞仪测定VP16组KB/ADM细胞的凋亡率为5.8％，VP16联合VRP或NC组分别为14.9％和17.3％。
2.体内动物模型实验研究结果
(1)实验结果显示KB/ADM细胞可以在裸鼠身上生长并繁殖，给药结束后剥离各组瘤体称重，与VP16组比较，VP16联合VRP或NC组瘤体体积与重量减少，说明联合用药后VRP和NC组裸鼠移植瘤的生长被抑制;HE染色结果观察到VP16组组织较完整，坏死范围小，VP16联合VRP或NC组可观察到瘤体组织坏死范围大，有明显空泡样改变;Hoechst33342染色结果显示单独使用VP16组细胞核形态正常呈较浅的蓝色荧光，VP16联合VRP或NC组肿瘤细胞数量减少，胞核收缩，核染色增强;TUNEL染色结果显示VP16组凋亡阳性率低，凋亡指数为15.45％，VP16联合VRP和NC组移植瘤的凋亡率明显增高，凋亡指数分别为48.03％和60.13％。
(2)CM-Dil标记的KB/ADM细胞注射到斑马鱼中可观察到肿瘤细胞的生长繁殖;空白对照组，单独使用VP16组，VRP组和NC组的荧光强度分别为:474934±36023，466046±28864，279622±17216和245544±16309，VP16组与空白对照组比较差异无统计学意义(p＞0.05)，VP16联合VRP或NC组与VP16组对比差异有统计学意义(p＜0.05)，说明联合用药后对斑马鱼移植瘤的生长具有抑制作用。
3.NC耐药逆转活性作用机制研究
(1)NC与拓扑异构酶的分子对接研究表明NC可能通过增强VP16与TopoⅡα的亲和性而逆转VP16的耐药性。通过TopoⅡα介导的解旋实验和嵌入实验表明NC对TopoⅡα酶有一定的抑制作用，其作用机制是嵌入TopoⅡα酶;
(2)在细胞、裸鼠移植瘤和斑马鱼中移植瘤模型中，与单独使用VP16组比较，TopoⅡα基因在VP16联合VRP或NC组中表达是下调，差异有统计学意义(p＜0.05)，说明NC耐药逆转过程中TopoⅡα基因表达是受到抑制的;与单独使用VP16组比较，TopoⅡα蛋白在VP16联合VRP或NC组中表达是下调，差异有统计学意义(p＜0.05)，说明NC耐药逆转过程中TopoⅡα蛋白表达是受到抑制的。
4.NC对TopoⅡα过表达细胞系的作用研究
(1)以1∶5稀释病毒液侵染KB细胞，并用0.5μg/ml puromycin连续作用4天筛选出稳定高表达TopoⅡα细胞系KB/2307，RT-PCR和Western Blot结果表明TopoⅡα基因和蛋白表达在KB/2307细胞中均上调。
(2)生长曲线结果显示KB/2307细胞的生长速度较KB细胞快;单独使用VP16和VP16联合NC组对KB/2307细胞的IC50分别为52.20±5.75和27.02±±2.14μg.mL-1，两组比较差异有统计学意义(p＜0.05);与单独使VP16组比较，VP16联合NC组划痕愈合速度明显减慢，可观察部分细胞死亡;Transwell实验中与VP16组比较，VP16联合NC组细胞的透膜数明显减少;Hoechst33342染色结果可见VP16组细胞核形态基本正常呈淡蓝色染色，可观察到有少量细胞凋亡，VP16联合NC组细胞数量减少，细胞核皱缩，荧光显微镜下可观察到明显的核染色增强;流式细胞仪检测用药后VP16组KB/2307细胞的凋亡率为10.3％，VP16联合NC组凋亡率为14.9％，联合用药后细胞凋亡率增加。
(3)与单独使用VP16比较，VP16与NC联用后TopoⅡα基因和蛋白表达下调，差异有统计学意义(p＜0.05)，说明VP16与NC联用后抑制了KB/2307细胞TopoⅡα的表达。
5.与单独使用VP16比较，在VP16联合VRP或NC组中PTEN和Caspase-3蛋白的表达是上调的，PI3K和p-AKT表达是下调的，而AKT的表达在各给药组间无明显变化，说明NC耐药逆转作用可能与影响了PTEN/PI3K/AKT信号通路有关。
结论:
NC在体外细胞模型中可以逆转KB/ADM细胞的多药耐药性，在体内动物模型中可以逆转KB/ADM细胞移植瘤的耐药性，具有较明显的耐药逆转作用;NC与TopoⅡα分子对接研究、NC对TopoⅡα体外抑制实验和NC耐药逆转过程中TopoⅡα基因及蛋白的表达变化表明NC的耐药逆转作用的靶点可能是TopoⅡα;NC对TopoⅡα过表达细胞具有抑制作用，并下调细胞中的TopoⅡα基因与蛋白表达，进一步验证了的作用靶点可能为TopoⅡα;NC耐药逆转过程中PTEN/PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达变化说明NC的耐药逆转作用可能与影响该通路有关。由以上结果我们推测NC耐药逆转的作用机制可能是嵌入TopoⅡα酶，增强VP16与TopoⅡα的亲和力，损伤细胞DNA，通过PTEN/PI3K/AKT信号通路诱导细胞凋亡。
研究氯化两面针碱对人口腔表皮样癌细胞多药耐药的逆转作用及其作用机制，为NC作为一种多药耐药逆转剂应用于临床肿瘤多药耐药提供依据。
方法:
1、体外细胞模型研究NC的耐药逆转活性。MTT法检测NC对6株多药耐细胞的抑制率，选取NC抑制率小于10％的浓度做为耐药逆转浓度;MTT法检测NC对6株细胞的耐药逆转的倍数，选取逆转作用效果最好的细胞用于后续研究;用药后HE染色观察细胞形态学变化，透射电镜观察细胞显微结构改变，AO/EB观察细胞凋亡形态，划痕实验和Transwell小室实验检测细胞的迁移侵袭能力，流式细胞仪检测细胞凋亡率。
2、体内动物模型研究NC的耐药逆转活性。裸鼠皮下接种多药耐药细胞，用药后记录瘤体体积变化，绘制瘤体生长曲线，HE染色观察瘤体组织形态学变化，透射电镜观察瘤体细胞显微结构改变，Hoechst33342染色观察细胞凋亡形态和，TUNEL染色观察瘤体组织细胞的凋亡指数;使用荧光素标记肿瘤细胞，显微注射接种至斑马鱼体内，建立斑马鱼移植瘤模型，荧光显微镜拍照分析用药后各组斑马鱼移植瘤荧光强度变化。
3、NC对多药耐药细胞的逆转活性与TopoⅡα的相关性研究，初步了解到NC多药耐药逆转作用的机制。采用计算机辅助药物设计软件将NC与TopoⅡα进行分子对接，在分子水平推测NC与TopoⅡα的结合和相互作用方式。采用TopoⅡα介导的DNA松弛实验和DNA嵌入实验，体外检测NC对TopoⅡα的抑制作用;RT-PCR分别检测细胞模型，裸鼠移植瘤模型和斑马鱼移植瘤模型中各组别TopoⅡα基因表达变化;Western Blot分别检测细胞模型，裸鼠移植瘤模型和斑马鱼移植瘤模型中各组别TopoⅡα蛋白的表达变化。
4、NC对TopoⅡα过表达细胞系的作用研究。采用慢病毒侵染方法构建TopoⅡα过表细胞系，MTT法检测过表达细胞系的生长曲线以及NC抑制率小于10％的浓度;用药后HE染色观察细胞形态学变化，Hoechst33342染色观察细胞凋亡，划痕实验和Transwell小室实验检测细胞的迁移侵袭能力，流式细胞仪检测细胞凋亡率，RT-PCR和Western Blot分别检测细胞内TopoⅡα基因与蛋白的表达变化。
5、NC耐药逆转过程中对PTEN/PI3K/AKT信号通路相关蛋白的影响。采用Western Blot检测NC耐药逆转过程中各组细胞的PTEN、PI3K、AKT、p-AKT和Caspase-3蛋白表达的变化，初步了解到NC耐药逆转过程PTEN/PI3K/AKT信号通路的变化。
结果:
1.体外细胞模型实验研究结果
MTT法测定NC耐药逆转浓度为1.5μg.mL-1;NC对6株多药耐药细胞的耐药逆转指数显示对KB/ADM细胞的耐药逆转作用最好;HE染色结显示VP16组细胞形态无明显变化，VP16联合VRP或NC组可观察到细胞数量减少，胞膜破损，核固缩等现象;透射电镜可观察到VP16组细胞形态完整，没有明显的凋亡现象，在VP16联合VRP或NC组观察到细胞皱缩，微绒毛结构减少甚至消失，胞浆空泡形成，核固缩，染色质浓集于核膜内侧等凋亡形态特征;与单独使用VP16比较，VP16联合VRP或NC组划痕愈合速度明显减慢，NC组可观察到部分细胞死亡;与单独使用VP16组细胞比较，VP16联合VRP或NC组细胞的透膜数明显减少;AO/EB染色实验中VP16组细胞形态较完整呈明亮的绿色荧光，VP16联合VRP或NC组细胞数量减少，细胞核皱缩，可观察到明显的橙红色荧光;流式细胞仪测定VP16组KB/ADM细胞的凋亡率为5.8％，VP16联合VRP或NC组分别为14.9％和17.3％。
2.体内动物模型实验研究结果
(1)实验结果显示KB/ADM细胞可以在裸鼠身上生长并繁殖，给药结束后剥离各组瘤体称重，与VP16组比较，VP16联合VRP或NC组瘤体体积与重量减少，说明联合用药后VRP和NC组裸鼠移植瘤的生长被抑制;HE染色结果观察到VP16组组织较完整，坏死范围小，VP16联合VRP或NC组可观察到瘤体组织坏死范围大，有明显空泡样改变;Hoechst33342染色结果显示单独使用VP16组细胞核形态正常呈较浅的蓝色荧光，VP16联合VRP或NC组肿瘤细胞数量减少，胞核收缩，核染色增强;TUNEL染色结果显示VP16组凋亡阳性率低，凋亡指数为15.45％，VP16联合VRP和NC组移植瘤的凋亡率明显增高，凋亡指数分别为48.03％和60.13％。
(2)CM-Dil标记的KB/ADM细胞注射到斑马鱼中可观察到肿瘤细胞的生长繁殖;空白对照组，单独使用VP16组，VRP组和NC组的荧光强度分别为:474934±36023，466046±28864，279622±17216和245544±16309，VP16组与空白对照组比较差异无统计学意义(p＞0.05)，VP16联合VRP或NC组与VP16组对比差异有统计学意义(p＜0.05)，说明联合用药后对斑马鱼移植瘤的生长具有抑制作用。
3.NC耐药逆转活性作用机制研究
(1)NC与拓扑异构酶的分子对接研究表明NC可能通过增强VP16与TopoⅡα的亲和性而逆转VP16的耐药性。通过TopoⅡα介导的解旋实验和嵌入实验表明NC对TopoⅡα酶有一定的抑制作用，其作用机制是嵌入TopoⅡα酶;
(2)在细胞、裸鼠移植瘤和斑马鱼中移植瘤模型中，与单独使用VP16组比较，TopoⅡα基因在VP16联合VRP或NC组中表达是下调，差异有统计学意义(p＜0.05)，说明NC耐药逆转过程中TopoⅡα基因表达是受到抑制的;与单独使用VP16组比较，TopoⅡα蛋白在VP16联合VRP或NC组中表达是下调，差异有统计学意义(p＜0.05)，说明NC耐药逆转过程中TopoⅡα蛋白表达是受到抑制的。
4.NC对TopoⅡα过表达细胞系的作用研究
(1)以1∶5稀释病毒液侵染KB细胞，并用0.5μg/ml puromycin连续作用4天筛选出稳定高表达TopoⅡα细胞系KB/2307，RT-PCR和Western Blot结果表明TopoⅡα基因和蛋白表达在KB/2307细胞中均上调。
(2)生长曲线结果显示KB/2307细胞的生长速度较KB细胞快;单独使用VP16和VP16联合NC组对KB/2307细胞的IC50分别为52.20±5.75和27.02±±2.14μg.mL-1，两组比较差异有统计学意义(p＜0.05);与单独使VP16组比较，VP16联合NC组划痕愈合速度明显减慢，可观察部分细胞死亡;Transwell实验中与VP16组比较，VP16联合NC组细胞的透膜数明显减少;Hoechst33342染色结果可见VP16组细胞核形态基本正常呈淡蓝色染色，可观察到有少量细胞凋亡，VP16联合NC组细胞数量减少，细胞核皱缩，荧光显微镜下可观察到明显的核染色增强;流式细胞仪检测用药后VP16组KB/2307细胞的凋亡率为10.3％，VP16联合NC组凋亡率为14.9％，联合用药后细胞凋亡率增加。
(3)与单独使用VP16比较，VP16与NC联用后TopoⅡα基因和蛋白表达下调，差异有统计学意义(p＜0.05)，说明VP16与NC联用后抑制了KB/2307细胞TopoⅡα的表达。
5.与单独使用VP16比较，在VP16联合VRP或NC组中PTEN和Caspase-3蛋白的表达是上调的，PI3K和p-AKT表达是下调的，而AKT的表达在各给药组间无明显变化，说明NC耐药逆转作用可能与影响了PTEN/PI3K/AKT信号通路有关。
结论:
NC在体外细胞模型中可以逆转KB/ADM细胞的多药耐药性，在体内动物模型中可以逆转KB/ADM细胞移植瘤的耐药性，具有较明显的耐药逆转作用;NC与TopoⅡα分子对接研究、NC对TopoⅡα体外抑制实验和NC耐药逆转过程中TopoⅡα基因及蛋白的表达变化表明NC的耐药逆转作用的靶点可能是TopoⅡα;NC对TopoⅡα过表达细胞具有抑制作用，并下调细胞中的TopoⅡα基因与蛋白表达，进一步验证了的作用靶点可能为TopoⅡα;NC耐药逆转过程中PTEN/PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达变化说明NC的耐药逆转作用可能与影响该通路有关。由以上结果我们推测NC耐药逆转的作用机制可能是嵌入TopoⅡα酶，增强VP16与TopoⅡα的亲和力，损伤细胞DNA，通过PTEN/PI3K/AKT信号通路诱导细胞凋亡。