昆虫杆状病毒是一类宿主特异性病毒,杆状病毒表达系统是一个高效的真核细胞表达系统,可通过昆虫幼虫或昆虫细胞来表达外源蛋白。近年来的研究表明杆状病毒可以介导功能性表达盒传递至哺乳动物细胞,并在哺乳动物启动子调控下表达外源基因。杆状病毒具有在哺乳动物细胞中不复制、无细胞毒性、可携带大片段DNA及操作简便等优点,作为非复制型载体,在基因工程疫苗的研制方面受到了广泛关注。近年来关于提高重组杆状病毒转染异源细胞的效率,以及如何延长外源基因在细胞中的表达时间倍受人们关注。本课题以此为目的,构建了两株含有真核细胞CBA启动子(CMV ie enhancer region与Chicken actin promoter region的复合型启动子)调控EGFP报告基因的转移载体,并获得重组杆状病毒,为基因工程疫苗的研制提供新的思路。本课题构建的两个重组杆状病毒转移载体均是以去掉pPolH启动子的pFastBac1质粒载体为骨架。首先依据杆状病毒假型化修饰技术,在病毒基因组中引入可增强重组病毒转染效率的截断型水疱性口膜炎病毒糖蛋白VSV-GED(Truncated vesicular stomatitis virus G protein,VSV-GED)序列,即将杆状病毒pPolH启动子调控的VSV-GED表达盒插入载体骨架中。随后,将CBA启动子调控的EGFP报告基因表达盒按与pPolH启动子相反的方向插入载体骨架。在CBA启动子下游插入人工构建的多克隆位点(MCS),以便于其它病原微生物的抗原基因替换EGFP基因,研制针对不同疾病的基因工程疫苗。在EGFP基因的3’非编码区中插入土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件WPRE(wood-chuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element),这是一个RNA顺势作用元件,用以增强EGFP基因的表达效率,由此得到第一个重组杆状病毒转移载体pSD-EGFP。在第一个载体的基础上,将延长报告基因表达时间的腺联病毒末端反向重复序列(Adeno-associated virus inverted terminal repeats,ITRs)引入CBA启动子调控的表达盒的两端,获得第二个转移载体pSD-ITRs-EGFP,与转移载体pSD-EGFP进行对照来比较ITRs对基因表达时间的影响。绘制限制性内切酶图谱对两个转移载体进行鉴定之后,将两个载体分别转化至E.coli DH10Bac感受态细胞中,提取重组Bacmid DNA,然后转染Sf9昆虫细胞,获得P1代重组病毒,经三次侵染Sf9昆虫细胞后获得高滴度的P3代病毒。将两株病毒和未经修饰的含有CBA启动子的对照病毒BV-CBA-EGFP分别转染鸡原代骨骼肌细胞,转染72h后,分析结果表明经过修饰改造的重组病毒介导的EGFP基因的表达明显增强。在本研究中,将病毒假型化技术与在病毒基因组中添加调控元件的方法共同用于提高重组杆状病毒介导外源基因的传递效率,为以重组杆状病毒作为基因传递载体研制基因工程疫苗奠定了坚实的基础。