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急性肺损伤／急性呼吸窘迫综合征(ALI／ARDS)是一种以中性粒细胞(PMN)肺浸润为主的肺部炎症性损伤，PMN等细胞所释放的各种酶、氧自由基、炎性介质是引起ALI的主要因素。虽然PMN已被确认在ALI的发病中具有核心作用，但PMN是如何被激活的目前还不清楚。 有丝分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)是丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶家族的组成成员，分布于包括PMN在内的多种细胞中，在生理反应中起到将外源刺激信号从细胞膜传导致胞核的作用。它共有三种形式：细胞外信号调节激酶(ERK)，P38MAPK，c-Jun N末端激酶(JNK)。现已发现，PMN中的MAPK，特别是ERK，能被不同的细胞外刺激如有丝分裂原、生长因子、氧化应激和细胞因子等所激活，激活后的ERK可调控cAMP反应结合蛋白(CREB)、核因子IL-6(NF-IL-6)、活化转录因子-2(Activating trans cription factor-2)及AP-1等的活化，进而影响PMN的基因转录和凋亡，可以推测PMN内MAPK的激活可能在ALI的发病中具有重要意义。为此，我们观察了ALI肺泡内PMN的凋亡延迟与MAPK激活之间的关系，以及肺内炎性介质的产生情况，以明确Raf-1→MEK-1→MAPK信号转导系统的激活在ALI发病机制中的作用。 本文通过先给大鼠气管内灌注少量稀盐酸(HCl)，24小时后再气管内注入内毒素(LPS，7.5mg／kg)的方法制造实验组大鼠ALI／ARDS模型，而以无菌注射用水气管内灌注作为对照。在注入LPS、无菌注射用水后，分别于不同时间点对实验组及对照组大鼠行肺泡灌洗术，将肺泡灌洗液(BLAF)离心，计数BALF内细胞数及各种细胞比例，测定肺湿-干重比。将分离的正常对照组大鼠外周血PMN分别与ALI组、正常对照组BALF的上清液无菌孵育16、24小时后，用Annexin Ⅴ方法测定PMN的凋亡率，并通过Western blot检测各组PMN内 解放军总医院／军医进修学院博士学位论文 ERK、磷酸化的ERK（P－ERK）的表达情况。同时，取ALI组及正常对照组肺组 织，行病理检查，并采用免疫组化的方法检查了Raf习—MEK习—ePK信号转 导系统的激活情况以及诱导型一氧化氮合酶O 人肿瘤坏死因子口 （TN－ ）的表达。 结果：（）实验组大鼠气管内注入 LPS后，出现明显的呼吸增快、紫甜等 表现，而注入无菌注射用水的对照组则无明显异常；实验组大鼠BALF中的PMN 数量和在白细胞中的比例显著增加，肺的湿－干重比也增大。肺组织病理切片 显示，实验组大鼠双肺出现弥漫性炎症反应，肺泡间隔增厚，肺泡腔充满血性 渗出物，肺泡间隔和肺泡内有大量的 PMN；而对照组则无改变。（2）正常外周 血PMN＋正常对照组BALF上清液体外孵育时，在最初的sh内细胞无明显凋亡， 其凋亡比例＜10％，sh以后凋亡开始迅速增加，24h时凋亡数达到高峰。而将正 常外周血 PMN与实验组 BALF的上清液共同孵育时，在 16h后虽也出现一定比 例的凋亡，但与同对照组BALF孵育时相比，其凋亡比例显著低于前者 （P＜0．01）。此外，16、24h时实验组BALF中PMN的凋亡比例，亦明显低于 正常外周血刚N＋对照组BALF孵育16、24h时的凋亡率（P＜0．01），且16h与 24h之间的凋亡率无差异（P＞0．05）。（3）正常外周血PMN中只有少量的ERK 表达，而无P－ERK出现：实验组SALr内的PMN及与实验组SALF孵育后的正常 外周血PMN，其ERK、P－ERK的表达明显增强；而正常外周血PMN＋正常对照组 BALF孵育时，其mK的表达无明显变化，P干RK仅微量表达。K）实验组肺组 织中阳Kl、ERK、P士RK的表达明显增强，但他fl的表达相对较弱。表达部 位主要分布于肺内浸润和渗出的PMN的胞浆内以及部分气道上皮和AM中，肺 泡间隔内也有少量表达。同时，在有MEK－1、ERK、P－ERK表达的肺组织中，也 有iNOS、TNF－口的强表达。而正常对照组肺组织中，这些激酶的表达强度较 弱，仅在个别细胞显示出免疫着色，特别是Rafl和P｛RK几乎无表达／、 TNF－a的表达也明显弱于实验组。 8 解放军总医院浑医进修学院博士学位论文 结论：1．采用＊－LPS双重打击的方法可以成功地复制类似于误吸后的 ALI八RDS模型。2．ALI大鼠BALF内的PMN存在着凋亡延迟，这种凋亡延迟与 ALI大鼠的BALF有关。ALI大鼠的BALF可使正常外周血PMN的凋亡发生延迟， 因而使肺泡内的PMN生存时间延长，加重ALI的肺泡炎。3．ALI肺泡渗出液内 的PMN中有ERK、P－ERK的表达，P－ERK占ERK的比例增大，提示ERK被激活； ALI的BALF能使正常外周血PMN中mK、P－ERK的表达增强，P－ERK／ERK值增 加。说明札 肺泡内刚N