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目的:探讨间充质干细胞上清(MSC-CM)对HD暴露VSC 4.1细胞过度凋亡的抑制作用及其分子机制。材料和方法:用2到3周龄SD大鼠来提取MSC-CM。VSC 4.1细胞分为5组:Control组、HD组、HD+5%MSC-CM组、HD+10%MSC-CM组、HD+15%MSC-CM组、HD+NGF组、HD+15%MSC-CM+anti-NGF组、HD+15%MSC-CM+Akt抑制剂(MK-2206)组、HD+15%MSC-CM+Trk A抑制剂(K252a)组。HD组用浓度25m M的HD处理生长状态良好的VSC 4.1细胞24小时,HD+MSC-CM组是HD染毒后弃培基,再分别加入不同体积比的干细胞上清,放入培养箱继续培养24小时,HD+NGF组是HD染毒后弃培基,加入浓度为100ng/ml的NGF继续培养24小时,HD+MSC-CM/NGF+抑制剂组是HD染毒24小时后,再分别加抑制剂预处理1小时,然后弃培基加MSC-CM或NGF继续培养24小时。用TUNEL法检测各组细胞凋亡;MTT法检测各组细胞存活和生长;Western-Blotting法检测各组细胞NGF、Trk A、p-Trk A、Akt、p-Akt、Bad、p-Bad和细胞色素C(Cyt C)蛋白表达;分光光度法检测细胞Capsase-3酶活性;免疫荧光细胞化学技术检测各组细胞Cyt C分布情况。采用SPSS19.0软件对数据进行统计分析。结果:1.MSC-CM对HD诱导的细胞凋亡的影响HD组的TUNEL阳性细胞数和Caspase 3活性值显著高于Control组(P<0.05),HD+MSC-CM组TUNEL阳性细胞数和Caspase 3活性值显著低于HD组(P<0.05),呈MSC-CM浓度依赖性降低。HD组凋亡指数分别为52%,显著高于Control组(4%)(P<0.05);HD+MSC-CM组凋亡指数分别为42%、30%、17%,显著低于HD组(P<0.05)。2.MSC-CM对细胞活力的影响HD组细胞活力值显著低于Control组(P<0.05),HD+MSC-CM组细胞活力值显著高于HD组(P<0.05),且呈剂量依赖性增加。将细胞活力与TUNEL的凋亡指数进行线性回归分析,结果显示两者呈明显的负相关,相关系数R2=0.8554。3.MSC-CM中NGF含量及MSC-CM对p-Trk A表达的影响ELISA检测MSC-CM中NGF含量为66.08 pg/ml。HD组p-Trk A蛋白表达量显著低于Control组(P<0.05),HD+MSC-CM组p-Trk A蛋白表达水平显著高于HD组(P<0.05),呈剂量依赖性增加。4.MSC-CM中NGF对HD诱导的细胞凋亡的影响HD组TUNEL阳性细胞数和Caspase-3活性值显著高于Control组(P<0.05),HD+MSC-CM组TUNEL阳性细胞数和Caspase-3活性值显著低于HD组(P<0.05),但在MSC-CM中加入了NGF中和性抗体(ab16161)后,结果反转。5.MSC-CM对p-Akt、p-Bad蛋白表达的影响HD组p-Akt、p-Bad蛋白表达量显著低于Control组(P<0.05);HD+MSC-CM组p-Akt、p-Bad蛋白表达显著高于HD组(P<0.05),但加入了Trk A受体的抑制剂(k252a)后,由MSC-CM提高的p-Akt与p-Bad的表达水平被反转(P<0.05)。6.MSC-CM对HD诱导的细胞线粒体Cyt C释放的影响免疫荧光和蛋白检测结果显示HD组细胞线粒体中Cyt C水平较Control组明显降低(P<0.05),但细胞质中,表达情况刚好相反;HD+MSC-CM组刚好扭转了这一情况。7.MSC-CM中NGF对HD诱导的细胞线粒体Cyt C的影响HD+NGF组细胞Cyt C在线粒体和细胞质中的水平与HD+MSC-CM组类似,但加入K252a后,MSC-CM及NGF的作用被反转。8.NGF介导的PI3K/Akt/Bad通路对凋亡的影响HD组细胞TUNEL阳性细胞数和Caspase-3活性值显著高于Control组(P<0.05),HD+MSC-CM组TUNEL阳性细胞数和Caspase-3活性值显著低于HD组(P<0.05),但加入了Akt抑制剂(MK-2206)后,MSC-CM及NGF的保护作用明显降低(P<0.05)。结论:MSC-CM抑制HD诱导的VSC 4.1细胞凋亡;MSC-CM的凋亡抑制作用可能与介导NGF激活PI3K/Akt/Bad信号通路有关。