一、目的与意义类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种慢性进行性的自身免疫性疾病。以关节滑膜炎及对称性、破坏性的关节病变为主要特征。RA的发病在全世界约为0.5%-1.0%,在我国约为0.4%,虽低于国外,但由于我国人口众多,估计患者总数约有600万之多;同时RA也是一大疑难病,有慢性、进行性、侵蚀性的特点,如不治疗在发病1-2年内,就可出现不可逆的骨质破坏,并成晚期可导致关节强直、畸形,致残率极高,患者生活质量较常人明显降低。尽管RA确切病因及发病机制尚未明确,但现在人们已认识到RA的发病除与环境因素有关外,与遗传因素也存在密切关系。随着免疫遗传学的发展,已有许多研究证实RA与人类白细胞抗原（human leucocyte antigen,HLA）相关。HLA复合体位于人类第6号染色体短臂上,其中HLA-Ⅱ类基因具有高度多态性,是参与机体特异性识别和免疫应答的主要成分,包括DR、DQ和DP三类基因,目前发现它们都与RA发病相关。近十余年来有关RA病机研究的最大进展就是发现与RA发生及病情进展密切相关的基因HLA-DR4,它在RA易感性中占30%-50%的作用。进一步研究HLA-DR4亚型发现,主要是DR4*0401（即基因型DRβ1*0401）、0404、0405、0408和DR1*0101亚型在RA发病中起主要遗传作用。在HLA-DRβ1基因第3超变区（HVR）编码的DR1和DR4蛋白β链的第70-74位含有谷氨酰胺-赖氨酸或精氨酸-精氨酸-丙氨酸-丙氨酸（QK/RRAA）序列,这些特殊的氨基酸序列（即RA共享表位,SE）可能通过呈递抗原或作为抗原片段介导RA的发病。近年来研究发现,HLA-DQ3也是RA相关的重要等位基因。特别是HLA-DQ3*0301亚型（即基因型DQβ1*0301）是RA的标志基因。HLA-DQβ1*0301与多数DR4单倍型基因存在连锁不平衡,研究发现,在RA发病人群中已检测到起重要作用的HLA-DR4-DQ3单倍型基因,该单倍型基因对RA的危险强度比单纯SE基因高5倍。有关HLA-DP基因与RA的相关分析相对较少,部分学者认为除了DR4在RA发病中的主要作用外,DP基因也可以影响疾病的易感作用,对疾病的发展起调节作用。HLA-DP*0401被认为是与RA相关的主要基因,而在SE阴性的RA,DPβ1*0201、0601可能是发病的危险因素。综合分析显示,RA是一种与多种免疫基因相关联的自身免疫性疾病。虽然其他遗传因素如TCR基因、免疫球蛋白基因、多肽转运蛋白基因亦与RA发病相关,但是HLA-Ⅱ类基因在发病中的作用是最明显的。由于RA发病机制未明,目前尚无令人满意的具有确切疗效且毒副作用小的药物。为了进一步探讨RA的病因、病理、免疫学、临床等方面的机制,以及寻找更有效的治疗RA的方案,建立良好的RA动物模型是当务之急。当前应用于RA研究的动物模型主要有诱导性,自身免疫性和移植型动物模型,其中研究最多的是胶原诱导性关节炎。然而,RA是由遗传、感染、环境、免疫等多种复杂因素共同作用而致,而RA动物模型只是侧重于某一个或某几个因素而建立起来的,没有一种模型能够完全模拟人RA状况。目前选用的RA动物模型在发病机制方面与人RA存在差别,所以选择与人RA发病机制及病理相同或相似的动物模型在RA研究中的作用也就越来越重要了。转基因动物是指用实验导入的方法使外源基因在动物染色体基因组内稳定整合,并能遗传给后代的一类动物。当外源基因在转基因动物体内表达,并培育出其表型与人类疾病症状相似的动物模型,则称其为转基因动物模型。国内外已建立了几种RA转基因鼠模型,这种模型产生疾病的原因清楚（由转入的外源基因引起）,模型动物的症状单一,接近于病人的症状。因此,转基因鼠动物模型的开发成为建立RA动物模型热点。目前RA相关基因转基因小鼠的构建还在起步阶段,绝大多数的实验室仍采用最经典的显微注射法。构建转基因鼠动物模型需要耗费大量的人力物力,因此必须作好完善的前期准备。其中,外源基因的结构和质量是转基因成功的必要条件之一。用于转基因的外源基因除了本身基因的特性和表达某一临床特征外,必须在转入动物体后能自身表达,并且可通过某种方法鉴定出来,因此首先研究外源基因能否在体外细胞表达显得尤为重要。二十几年来国内外已经有一些学者开展了HLAⅡ类分子转染小鼠成纤维细胞的研究,并取得了一些成果。我们拟将HLA-DR0401和人CD4基因转染入小鼠成纤维细胞系L929中。HLA-DR0401在RA发病中起主要遗传作用,CD4分子是主要组织相容性复合体Ⅱ类（major histocompatibility complexⅡ,MHCⅡ）分子的共受体。研究表明,RA发病与CD4⁺T细胞有密切关系,CD4抗原与抗原提呈细胞（APC）提呈的抗原多肽结合,能提高摄取HLA-DR抗原的能力。本研究的目的是转化和扩增人CD4和HLA-DR0401载体,并使其在小鼠成纤维细胞系L929中得到表达,为下一步RA转基因鼠模型的构建奠定实验基础。二、方法与内容1.pcDNA3-CD4和pLNCX2-DR*0401的转化、扩增取DH5α感受态菌置于冰浴中,向感受态细胞悬液中加入1μl的质粒,混匀后在冰浴中静置30min,再经42℃水浴90s后迅速置冰浴中2min。在上述体系中加入500μl的LB培养基,37℃振荡（150rpm）培养45min。取100μl已转化的感受态细胞涂布于含氨苄青霉素（Amp）的LB固体培养基上,置平皿于室温直至液体被吸收,倒置平皿,37℃培养12-16小时。挑取菌落进行扩大培养后,按质粒提取试剂盒的说明操作,进行质粒的抽提。2.pcDNA3-CD4和pLNCX2-DR*0401的鉴定根据质粒图谱,先用限制性内切酶双酶切进行质粒的初步鉴定,再将质粒pcDNA3-CD4送广州Invitrogen公司进行序列测定,将质粒pLNCX2-DR*0401送大连TaKaRa公司进行序列测定。3.L929细胞株的培养、传代L929细胞用含有RPMI1640+10%小牛血清+1%双抗的完全培养基培养,传代时用胰蛋白酶—EDTA液将处于对数生长期的细胞从瓶壁上消化下来。加新鲜培养液调整细胞浓度,然后分瓶继续培养。每天换液,传代时间一般为两天。4.脂质体法转染L929细胞转染过程依照Lipofectamine^TM脂质体转染试剂盒说明进行,并对具体条件进行优化。具体如下:转染前一天,将处于对数生长期的L929细胞消化传代,以4×10³/mL的细胞密度,1mL的量接种于6孔板中。细胞生长汇片至90%时,将pcDNA3-CD4和pLNCX2-DR*0401分别与脂质体以1:3的比例混合,无血清培养基孵育20min后加入到培养的L929细胞上。培养6h后,换为含20%胎牛血清的1640的培养液培养48h。5.人CD4和HLA-DR0401在L929细胞中的表达和鉴定（1）流式细胞术测定收集1×10⁶个转染细胞,4℃以上冷PBS洗一次,100μlPBS悬浮细胞,分别加入20μl FITC标记的抗人CD4单克隆抗体（RPA-T4）和PE标记的抗人HLA-DR单克隆抗体（LN3）,4℃避光孵育1h,用PBS洗细胞两次,用200μlPBS悬浮细胞后送测。（2）直接免疫荧光测定转染细胞爬片,4%多聚甲醛固定30min,PBS洗片3次,干燥后分别加入20μl FITC标记的抗人CD4单克隆抗体（RPA-T4）和PE标记的抗人HLA-DR单克隆抗体（LN3）,4℃湿盒避光孵育过夜。PBS洗片3次后50%甘油封片,荧光显微镜下观察。三、结果与分析1.扩增质粒的纯度和浓度经转化和克隆筛选,提取的pcDNA3-CD4质粒其A260/A280比值为1.86,浓度为474ng/μl,pLNCX2-DR*0401质粒其A260/A280比值为1.90,浓度为182ng/μl,说明经转化后获得质粒纯度高,质量好。2.pcDNA3-CD4和pLNCX2-DR*0401的鉴定（1）pcDNA3-CD4的酶切及测序鉴定结果质粒pcDNA3-CD4经单酶切后产生一条长约8.5kb的片段;按照质粒结构图,经NruⅠ和PinAⅠ双酶切,产生两条片段,分别为2250bp和6221bp。酶切鉴定正确,对质粒pcDNA3-CD4进行序列分析,将测定序列与GenBank登录的CD4基因（NM-000616）序列进行比较,证明测定序列完全正确。（2）pLNCX2-DR*0401的酶切及测序鉴定结果质粒pLNCX2-DR*0401经单酶切后产生一条长约8.3kb的片段;按照质粒结构图,经BglⅡ和NotⅠ双酶切,产生两条片段,分别为2233bp和6102bp。酶切鉴定正确,对质粒pLNCX2-DR*0401进行序列分析,将测定序列与GenBank登录的HLA-DRα基因（NM-019111）序列进行比较,证明测定序列完全正确。从反向设计测定HLA-DRβ1序列时,因样品存在高级结构,测序终止。3.L929细胞株的培养、传代L929细胞生长状态良好,呈梭形、大多角形或扁平星形。4.脂质体法转染L929细胞转染48h后,约5%细胞死亡,细胞形态与转染前比较无明显变化。5.人CD4转染细胞流式细胞术的检测采用FITC标记的抗人CD4单克隆抗体（RPA-T4）对人CD4蛋白在转染后的L929细胞中的表达做测定,以转染了pcDNA3-CD4质粒但未加抗体的L929细胞和未转染质粒但加了抗体的L929细胞做对照。结果显示对照组未检出荧光标记阳性的细胞,而转染了人CD4质粒的L929细胞中有61%的细胞为荧光标记阳性。6.HLA-DR0401转染细胞流式细胞术的检测采用PE标记的抗人HLA-DR单克隆抗体（LN3）对HLA-DR0401蛋白在转染后的L929细胞中的表达做测定,以转染了pLNCX2-DR*0401质粒但未加抗体的L929细胞和未转染质粒但加了抗体的L929细胞做对照。结果显示对照组未检出荧光标记阳性的细胞,而转染了HLA-DR质粒的L929细胞中仅有1%的细胞为荧光标记阳性。7.直接免疫荧光法检测人CD4和HLA-DR的表达采用FITC标记的抗人CD4单克隆抗体（RPA-T4）,通过直接免疫荧光法对人CD4蛋白在转染后的L929细胞中的表达做测定,以转染了pCDNA3-CD4质粒但未加抗体的L929细胞和未转染质粒但加了抗体的L929细胞做对照。结果显示对照组无荧光标记检出,而转染了人CD4质粒的L929细胞可见明显绿色荧光。证实人CD4蛋白在细胞中得到表达。采用PE标记的抗人HLA-DR单克隆抗体（LN3）,通过直接免疫荧光法对转染了HLA-DR质粒的细胞做测定则无荧光标记检出。四、结论成功转化并扩增了人CD4和HLA-DR0401表达载体,并转染小鼠成纤维细胞系L929,质粒pcDNA3-CD4得到高表达,可以作为转基因实验的目的基因,而质粒pLNCX2-DR*0401929细胞中体外没有得到表达,尚需要进行改良。本研究为下一步转基因模型的构建奠定了实验基础。