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肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是运动神经元疾病的一种亚型,是常见的神经系统变性疾病,主要表现为上、下运动神经元同时受累所致的肢体肌肉萎缩和瘫痪,最终多因延髓麻痹或肺部感染而死亡。研究发现,以ALS为代表的运动神经元疾病与帕金森病、Huntington舞蹈病、脊髓小脑性共济失调和阿尔茨海默病等神经系统变性疾病除细胞死亡在中枢神经系统中的分布不同以外,具有相同的病理生理学特点和细胞死亡方式,且在病灶中均发现有不溶性蛋白质的沉积。因此通过某一疾病的深入研究有可能揭示许多神经系统变性疾病的发病机制,为这些疾病的治疗和预防打下理论基础。家族性ALS (familial ALS,FALS)虽然仅占所有ALS的10%20%,大约20%的FALS与编码Cu/Zn超氧化物歧化酶(Cu/Zn SOD1)的基因突变有关,但由于与散发性ALS (sporadic ALS,SALS)具有相同的组织病理学特点和临床表现,因此SOD1突变转基因小鼠的出现为ALS的发病机制研究提供了很好的疾病模型。目前关于选择性运动神经元丢失的假说主要包括:①自身免疫机制;②氧化损伤;③细胞外谷氨酸失衡导致的兴奋毒性;④神经中丝的过度磷酸化;⑤线粒体功能异常等。但任何一种机制都无法满意解释ALS选择性损害运动神经元的特征,因此ALS的致病机制不可能是单一因素,而可能是多种因素共同作用的结果,导致疾病发生最终的原因是蛋白表达的紊乱,而基因水平的异常变化是致病的基础原因。据估计人类基因组70%以上的基因涉及了mRNA的可变剪接,这使得人类在蛋白质组的复杂性上比其它生物高出很多,这也给研究人员在研究疾病机理和找出治疗方法上带来极大的困难。最近就有一些研究报道核酸水平外显子剪接是致病的关键,尤其是在ALS中。但在此方面的研究由于技术等的限制未能深入开展,因此从核酸水平研究ALS发病机制及运动神经元保护研究是非常有必要的。但是目前针对核酸水平的研究仅应用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术逐一分析是非常局限的。人类基因组计划(human genome project, HGP)的完成,极大地带动了人类疾病相关基因的定位、克隆、结构与功能研究。人类基因组草图基本绘就之后,人类基因组计划也由此加入到功能基因组时代,生命科学的重点也由基因序列研究上升为基因功能研究,基因芯片是在这个背景下发展起来的一项先进技术。与传统方法相比,它具有快速、高通量、高准确性、低成本等特点,能够满足临床基因检测的要求;且其操作简单、易于标准化、适于推广,显示出广阔的临床应用前景。现今诞生了一种更为先进可靠地芯片技术——Affymetrix外显子芯片,用于高密度高通量的基因层面全景扫描,预测转录本的拼接方式,探索更为精细的转录事件,在转录水平显示出更为广阔的应用。本课题正是应用此种芯片技术深入研究ALS可能的致病机制,以求寻找到有效地治疗手段实验研究论文由三部分组成:第一部分应用外显子芯片分析hSOD1-G93A小鼠发病前期腰髓组织,研究探讨ALS症状前期全基因表达谱的变化以及转录水平的异常改变;第二部分应用外显子芯片分析hSOD1-G93A小鼠症状期腰髓组织,研究ALS疾病发病后症状期全基因表达谱的变化以及转录水平的异常改变;第三部分利用聚合酶链式反应技术验证芯片结果并研究Nox2和PI3K的表达变化以及Fyb的选择性剪接事件,探讨PI3K/Rac1/Nox2/ROS信号通路在ALS发病中的作用。第一部分hSOD1-G93A小鼠症状前期腰髓的转录水平变化及机制探讨目的:应用外显子芯片对处于症状前期的突变SOD1转基因小鼠及同窝对照的腰髓组织进行全基因组扫描,从基因表达水平和外显子剪接水平分析研究与ALS发病可能相关的基因和信号通路,探讨可能的疾病启动机制及症状前期转录水平的改变。方法:选择携带hSOD1-G93A的30天雌性转基因小鼠3只及同窝未携带hSOD1-G93A的30天雌性小鼠3只,组成症状前期组和对照组(n=3),简称为30A组和30C组。应用聚合酶链反应将小鼠尾巴组织提取出的DNA进行扩增验证是否携带突变基因。30天时10%水合氯醛深度麻醉后处死小鼠,迅速分离出脊髓腰髓段(L3到L5段)并去除脊膜,分成2段,一段迅速浸入液氮中,之后放置-80°C冰箱内保存。同时另一段浸入RNAlater(RNA稳定试剂)中,之后应用Trizol试剂(Trizol? Reagent,Invitrogen公司)按照其操作说明提取总RNA并用总RNA纯化试剂盒(RNeasy Mini kit, Qiagen公司)按其操作说明进行纯化。纯化后,RNA的质量及数量应用RNA 6000 Nano芯片试剂盒(RNA 6000 Nano Chip kit,Agilent Technologies公司)及安捷伦2100生物分析仪(Agilent 2100 bioanalyzer, Agilent Technologies公司)进行分析鉴定。RNA样本经光谱光度测量定量。之后的操作流程依据外显子芯片(Affymetrix GeneChip? Mouse Exon 1.0ST array)制造商的技术指导说明进行。大致如下:双循环单链cDNA合成及生物素标记—芯片杂交—芯片清洗染色、扫描。获得的大量数据主要由Affymetrix Expression Console Software Version 1.0软件分析处理,运用MAS系统(Molecule Annotation System)深入挖掘和理解高通量实验数据的生物学意义,并提供图形化的显示结果,比如异常基因的功能聚类分析(GO分析)和信号通路分析。结果:在30A组和30C组两组比较中,基因表达谱水平仅有1个基因(数据库中未给出注解)在30A组中表达高于30C组2.8倍,共有4个基因在30A组的表达高于30C组1.5倍以上,且仅有1个基因有注释,称之为类S样Fc受体样清除受体(receptor-like S scavenger receptor, NM030707);未发现有1.5倍以上表达下调的基因。在外显子水平,共有85个探针选择区域(probe select regions, PSRs)确定为发生选择性剪接的外显子,分别属于85个转录本(alternatively spliced transcripts, ASTs),仅有36个所属基因给出注释。对NM030707基因及36个可变剪接基因进行GO分析及通路分析,未发现与ALS明确的直接相关的致病因素,对新的发现在今后将作进一步深入研究。结论:与对照组相比,致病性hSOD1-G93A基因突变在ALS症状前期对基因表达谱几乎没有明显影响,在转录水平,未发现已知的可变剪接,表明在症状前期不存在明显的选择性剪接异常。推测出现的新基因及新的异常剪接事件可能与hSOD1-G93A基因在症状前期致病性有关,今后将会就这些新发现进一步深入研究。第二部分hSOD1-G93A小鼠症状期与症状前期腰髓的转录水平变化比较及机制探讨目的:应用外显子芯片对处于发病后症状期的突变SOD1转基因小鼠及症状前期转基因小鼠的腰髓组织进行全基因组扫描,从基因表达水平和外显子剪接水平分析研究与ALS发生发展可能相关的基因和信号通路,探讨可能的致病机制及疾病症状期转录水平的改变。方法:选择携带hSOD1-G93A的处于症状期(120天左右)的雌性转基因小鼠3只及携带hSOD1-G93A的30天雌性转基因小鼠3只,组成疾病症状期组和症状前期组(n = 3),简称为SYMPTOM组和30A组。应用聚合酶链反应将小鼠尾巴组织提取出的DNA进行扩增验证是否携带突变基因。经过行为学观察和体重变化观察后选择适当时间点处死小鼠,取出新鲜腰髓组织(L3到L5段)。SYMPTOM组小鼠的体重变化和行为学评价于90天时开始观察,每周测试2次。迅速分离出脊髓腰髓段去除脊膜后,分成2段,一段迅速浸入液氮中,之后放置-80°C冰箱内保存。同时另一段浸入RNAlater(RNA稳定储存试剂, Qiagen公司)中,之后总RNA提取纯化及外显子芯片操作流程与第一部分相同。芯片扫描获得的大量数据由Affymetrix Expression Console Software Version 1.0软件分析处理,运用MAS系统深入挖掘和理解高通量实验数据的生物学意义,并提供图形化的显示结果,比如异常基因的功能聚类分析(GO分析)和信号通路分析。结果:在SYMPTOM组和30A组两组比较中,共确定有2869个基因存在表达变化,其中包括263个基因在SYMPTOM组比30A组表达上调2倍以上和71个基因SYMPTOM组比30A组表达下调2倍以上(P <0.05);在外显子水平,共有630个PSRs确定为发生选择性剪接的外显子,分别属于563个ASTs。其中,在显著表达变化的基因中有16.2% (54/334)的基因包含有剪接异常外显子,这也表明可能存在转录与剪接的组合调控。选出发生2倍以上变化的100个基因(90个表达上调基因和10个表达下调基因)列表展示,并将这100个基因进行GO分析将基因功能化分组和通路分析将基因通路化分组;在外显子水平,筛选出46个可靠性更高的异常剪接外显子列表展示,并将这46个ASTs进行GO分析将基因功能化分组和通路分析将基因通路化分组(结果见附图)。30A vs 30C中的4个1.5倍以上表达上调变化的基因在SYMPTOM vs 30A中也检测到其上调变化,但因P值均大于0.05,没有统计学意义,也就是说,在SYMPTOM vs 30A中有330个明显表达变化基因(fold change≥2或≤0.5,P<0.05)是随疾病进程新出现的;30A vs 30C中85个ASTs在SYMPTOM vs 30A中检测到有7个重复出现选择性剪接,另外的78个因在SYMPTOM vs 30A中改变没有统计学意义而未检测出,也就是说,在SYMPTOM vs 30A中有556个ASTs是随疾病进程新出现的。结论:与30A组相比,SYMPTOM组小鼠在发病初期出现了许多基因表达水平与转录水平的交叉改变,推测外显子的选择性剪接和转录本表达量之间具有高度相关性,二者可能存在复合调节;症状期小鼠与症状前期小鼠相比基因水平和外显子水平的异常改变明显多于30A组和30C组两组比较的结果,表明突变SOD1可能引发了一系列病理性级联放大效应导致神经元损伤,推测ALS可能是突变SOD1的在众多关键生理病理进程中的累积放大效应的结果;另外,这些异常改变极少部分已被之前的研究报道证实,但大部份是由本次研究预测得到,这为进一步在转录水平研究ALS的可能致病机制及发现可能的治疗方法提供了新的方向,极大地提高了科研的有效性。第三部分PI3K/Rac1/Nox2/ROS信号通路在hSOD1-G93A小鼠中的表达及机制探讨目的:通过检测hSOD1-G93A小鼠症状期、症状前期及症状前期同窝对照的腰髓组织中PI3K及Nox2的表达情况以及Fyb中外显子选择性剪接情况,了解运动神经元损伤过程中PI3K/Rac1/Nox2/ROS信号通路有无变化,从转录水平探讨ALS发病的可能机制。同时可验证外显子芯片结果分析的可靠性。方法:选择携带hSOD1-G93A的处于症状期(120天左右)的雌性转基因小鼠3只、携带hSOD1-G93A的30天雌性转基因小鼠3只及同窝未携带hSOD1-G93A的30天雌性小鼠3只,组成疾病症状期组、症状前期组和前期对照组(n = 3),简称为SYMPTOM组、30A组和30C组。应用聚合酶链反应将小鼠尾巴组织提取出的DNA进行扩增验证是否携带突变基因。经过行为学观察和体重变化观察后选择适当时间点处死小鼠,取出新鲜腰髓组织(L3到L5段)。SYMPTOM组小鼠的体重变化和行为学评价于90天时开始观察,每周测试2次。迅速分离出脊髓腰髓段去除脊膜后,迅速浸入液氮中,于-80°C冰箱内保存。此段用于RNA提取后应用RT-PCR分析PI3K及Nox2的表达情况以及Fyb中外显子选择性剪接情况。结果:腰髓组织中的PI3K及Nox2基因在SYMPTOM组与30A组相比有显著上调,且各自的上调程度与芯片结果相一致,但在30A组和30C组比较中没有有意义的变化。Fyb基因的第19号外显子(SI = 5.25, P=0.042)在SYMPTOM组小鼠腰髓组织中有高表达而在30A组中表达明显下调,预测有剪接异常发生,这与芯片结果相一致。结论:在ALS发生发展过程中,PI3K及Nox2基因在症状期小鼠腰髓组织表达明显增加,提示自由基反应活力提高,而在症状前期PI3K/Rac1/Nox2/ROS信号通路无明显变化。与此通路相关联的Fyb基因同时存在剪接异常调节过程,推测可能存在基因表达水平和外显子异常剪接之间的复合调节,为有效控制ALS进展提供一条新思路奠定了实验理论基础。所有以上结果表明该外显子芯片对基因水平和外显子水平的检测结果可以是足够可靠且有效的。