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补体（complement system）系统是动物体免疫系统进化历程中出现比较早的抵抗外源微生物入侵的重要成分,鱼类补体由35种以上蛋白质裂解酶、酶抑制因子和受体构成,是机体内复杂的限制性蛋白溶解系统,分为经典途径（Classical pathway,CP）,旁路途径（Alternative pathway,AP）和凝集素途径（Lectin pathway,LCP）三种激活途径,能够识别外来病原入侵信号,参与鱼类特异性免疫反应和非特异性免疫反应,在先天性和获得性免疫起重要作用。补体调控因子I（complement factor I,Cfi）是一类在补体系统级联反应中扮演重要作用的丝氨酸蛋白酶,主要在肝脏中合成,发挥着免疫调节的作用,在一些底物调控辅因子,例如Cfh（Complement factor H）、C4bp（C4 Binding Protein）和CR1（Complement Receptor 1）的存在下,Cfi能够切割并抑制C3b和C4b的活性,防止生物体补体系统的过度激活,发挥调控补体系统的作用;补体C3分子是一类重要的免疫学分子,是血清中含量最高的补体成分,在先天性免疫和适应性免疫系统中,都起着重要的作用。在三种补体途径中,补体C3分子是作为重要的交汇分子存在着,C3主要由巨噬细胞和肝脏合成,在C3转化酶的作用下,裂解成C3a和C3b两个片段,进而在抗原抗体复合物或病原体的刺激下,通过级联反应,活化补体C3,随后在靶细胞表面上形成膜攻击复合体,最终达到裂解靶细胞的目的。半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）是我国重要的养殖鲆鲽鱼类之一,然而病害问题,特别是细菌性疾病在很大程度上制约了半滑舌鳎养殖产业的健康发展。本实验室近五年来开始了半滑舌鳎补体系统的研究,本论文研究内容是半滑舌鳎补体调控因子I进行了基因的鉴定、原核重组蛋白的表达以及其活性蛋白的功能分析,C3-1基因进行了克隆鉴定及感染鳗弧菌后m RNA的表达分析,主要研究结果如下:1半滑舌鳎补体Cfi基因的研究1.1Cfi克隆鉴定及序列分析在本实验已经构建的半滑舌鳎c DNA文库及已有的Cfi研究工作的基础上,本研究通过普通PCR克隆测序,获得了半滑舌鳎Cfi全长c DNA（命名为Cscfi）序列为2231bp,包括99bp 5’-非编码区（untranslated region,UTR）,164bp 3’-UTR,1968bp开放阅读框（open reading frame,ORF）。预测的蛋白编码656个氨基酸（animo acid,aa）,多肽链的分子量为72.28 k Da,等电点p I为7.11。与其它脊椎动物,包括哺乳动物、鸟类、软骨鱼、硬骨鱼及两栖类Cfi蛋白的同源比对结果显示,序列相似性高达39%-65%,Cfi蛋白具有一段由30个氨基酸组成的信号肽和5个保守域,即FIMAC（Factor I membrane attack complex）结构域、SRCR（Scavenger receptor cysteine-rich）结构域、LDLa1（Low-density lipoprotein receptor type A 1）结构域、LDLa2（Low-density lipoprotein receptor type A 2）结构域和SP（Trypsin-like serine protease）结构域。成熟的Cfi是由重链和轻链组成的异质二聚体,FIMAC、SRCR、LDLa1和LDLa2组成重链,SP结构域组成轻链,重链和轻链之间由四个带正电荷的氨基酸（Arg-Val-Arg-Arg,RVRR）连接,N连接的糖基化位点有7个,其中6个位于重链,1个位于轻链,且序列中存在大量保守的半胱氨酸。1.2 Cfi重组蛋白的获得及功能分析根据获得的Cscfi基因序列,设计特异性引物,以肝脏组织c DNA为模板,PCR扩增获得Cfi的ORF序列。根据T-A克隆原则将其连接到表达载体p EASY-E1质粒中,构建成原核表达载体p EASY-E1-Cfi,转化到大肠杆菌BL21（DE3）ply S中,诱导表达重组蛋白（recombinant protein of Cs Cfi,r Cs Cfi）。根据亲和层析原理,使用GE-AKa Ta Box-900液相色谱分离系统和His TrapTM FF柱子分离纯化得到r Cs Cfi蛋白,并使用SDS-PAGE电泳检测纯化效果。通过Western Blot和二级质谱验证r Cs Cfi蛋白的可信度,Western Blot结果显示杂交显色后在70k Da处获得单一条带,二级质谱结果显示r Cs Cfi蛋白分子量大小71.38k Da,等电点（p I）为6.67,与预测大小基本相符,并且有15条多肽段与预测序列能够匹配,且氨基酸的覆盖率为62%。通过菌落计数法分别检测了其对三种革兰氏阴性菌:大肠杆菌（Escherichia coli）、希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）、假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）,和一种革兰氏阳性菌:金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）的抑菌效果。结果表明,r Cs Cfi蛋白对两种类型菌都有广谱抑制效果,其中对大肠杆菌的最低抑菌浓度（英文全称,MIC）在0.03 mg/m L和0.08 mg/m L之间,对其它三种菌的MIC范围是0.01-0.05 mg/m L。此外,采用腹腔注射法向健康半滑舌鳎分别注射浓度为0.6μg/g、0.8μg/g、1.0μg/g、1.2μg/g和1.5μg/g的r Cs Cfi蛋白后,在注射蛋白后0h、6h、12h、24h和48h 5个时间点检测四种主要的免疫组织（肝脏、脾脏、头肾及小肠）中Cfi下游基因C3-1及Cfh表达量变化,结果显示C3-1和Cfh表达量都有显著的变化,且变化的趋势在各个浓度下呈现基本一致的趋势,在1.5μg/g的浓度下各个组织中C3-1和Cfh的变化适中且表达量较高。选取浓度为1.5μg/g的r Cs Cfi蛋白进行腹腔注射,在注射蛋白后0h、6h、12h、24h、48h、72h、96h和7d 8个时间点检测四种免疫组织（肝脏、脾脏、头肾及小肠）中Cfi下游基因C3-1及Cfh表达量变化,结果显示在脾脏、肝脏和小肠中,重组蛋白引起C3-1及Cfh基因分别在注射后6h、12h和48h出现最大值,为注射前的几倍到几十倍,其中,在肝脏中表达量变化最大。在肾脏中,重组蛋白能引起C3-1及Cfh基因下调表达,在24h达到最低点。2半滑舌鳎补体C3-1初步研究2.1 C3-1克隆验证及序列分析本研究通过实验室构建好的半滑舌鳎c DNA文库,获得了半滑舌鳎补体C3-1的部分c DNA序列,克隆号为（csgtsa00003A04）。根据已有序列设计特异性引物,以肝脏c DNA为模板,使用RACE（rapid amplification of c DNA ends）和普通PCR克隆测序技术扩增获得了长度为5130bp的半滑舌鳎补体基因C3-1的全长c DNA序列（命名为Cs C3-1）,包括37bp 5’-UTR,128bp 3’-UTR和4965bp的ORF序列。在线软件预测结果显示半滑舌鳎C3-1基因编码1655个aa,多肽链的分子量为184.98k Da,等电点p I值为6.46。半滑舌鳎补体C3-1的氨基酸二级结构从C端到N端依次为:信号肽SP（1-23aa）、α-巨球蛋白结构域A2M-N（130-227aa）、α-巨球蛋白结构域A2M-N-2（453-593aa）、过敏毒素同源结构域ANATO（682-717aa）、α-巨球蛋白结构域A2M（759-858aa）、α-巨球蛋白巯基脂类形成结构域Thiol-ester-C1（992-1022aa）、α-巨球蛋白补体组分结构域A2M-Comp（1044-1274aa）、α-巨球蛋白受体结构域A2M-recep（1383-1477aa）和神经生长因子C端结构域C345C（1516-1636aa）。进化树结果表明半滑舌鳎C3-1首先与牙鲆鱼聚为一支,进而与其他硬骨鱼聚为一类,远离哺乳动物、两栖类和鸟类。多序列氨基酸比对结果表明C3-1相似度在40-69%之间,显示其结构在进化上的保守性。2.2鳗弧菌感染前后C3-1的表达特征实时定量PCR结果显示:在健康的半滑舌鳎9种组织（肝脏、脾脏、头肾、血液、皮肤、脑、肌肉、鳃和肠）中均有C3-1的表达,在脑中表达量最高,其次为肝脏、肌肉和血液,在肾和鳃中表达量较低,在脑和肝脏中的表达量明显高于其他组织;在实验室已获得鳗弧菌（Vibro anguillarum）半致死浓度的基础上,人工腹腔注射2×107 CFU（colony forming units）鳗弧菌后解剖获取4种免疫组织（肝脏、血液、脾脏、头肾）提取RNA并反转录后进行实时定量PCR（real-time quantative PCR）表达分析,鳗弧菌感染半滑舌鳎后,各组织中C3-1的变化都会相应的上调或者下调表达。在肝脏和血液中,C3-1表达量都在12h达到最高,分别是感染前的5.5和15.5倍,24h肝脏中出现下调表达,达到最低,为感染前的0.3倍。在头肾中,C3-1表达量分别在6h和24h有很高的表达量变化,在24h达到最高,为感染前的几十倍。在脾脏中,C3-1表达量在第7d之前都一直处于下调表达,7d的表达量和感染前无显著性差异。本研究通过分子生物学手段获得了半滑舌鳎补体Cfi和C3-1的全长c DNA序列,分析了其氨基酸结构,在获得重组r Cs Cfi蛋白后,证明了其在体外具有抗菌活性,并能够在生物体内引起下游基因Cfh和C3-1表达量的变化。而在半滑舌鳎感染鳗弧菌后,能够引起C3-1基因的特异性表达。本研究从生物学角度出发,为半滑舌鳎工厂化科学养殖的发展提供了一个可借鉴的方向,抗菌产品的开发,饲料添加剂的应用对健康养殖及食品安全有重要的意义。