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目的: 课题组前期基因芯片分析发现睾丸孤儿核受体4(TR4)是黄芪汤干预二甲基亚硝胺(DMN)大鼠模型变化最显著的差异基因;体内外实验研究结果显示,黄芪汤组分黄芪总皂苷(AST)和甘草酸(GA)是黄芪汤抗肝纤维化的主要药效组分,两者配伍具有协同作用。基于此结果,本研究探讨TR4在肝星状细胞活化中的作用及黄芪汤组分AST、GA的干预效应。 方法: 1、采用蛋白免疫印迹法检测胆管结扎(BDL)大鼠肝纤维化模型肝组织的TR4蛋白表达变化,同时采用免疫组织化学染色方法观察肝组织TR4蛋白表达。 2、研究TR4对JS1细胞活化的影响:制备TR4基因干扰和过表达的慢病毒载体,体外转染JS1细胞,并经嘌呤霉素筛选稳定转染细胞。Real Time PCR及蛋白免疫印迹法验证TR4基因干扰和过表达效果,CCK8法检测细胞增殖,Real TimePCR及蛋白免疫印迹检测JS1细胞活化指标(α-SMA、ColⅠ)、TGF-β1/smads信号通路指标(TGF-β1、TβRⅠ、smad2、smad3、smad7)、维甲酸受体(RXRα、RARβ)的mRNA和蛋白表达水平。 3、研究AST和GA对JS1细胞活化的效应机制:分别给予AST、GA两者分别单用或联用干预JS1细胞24小时后,CCK8法检测细胞增殖,细胞免疫荧光检测F-actin表达,提取总RNA和蛋白检测JS1细胞活化指标(α-SMA、ColⅠ)、TGF-β1/smads信号通路指标(TGF-β1、TβRⅠ、smad2、smad3、smad7)、维甲酸受体(RXRα、RARβ)及TR4的mRNA和蛋白表达水平。 4、研究AST和GA对TR4过表达JS1细胞活化的影响:构建TR4过表达细胞(TR4-JS1),分别用AST、GA两者单用或联用干预24小时后,提取总RNA和蛋白,检测JS1细胞活化指标(α-SMA、ColⅠ)、TGF-β1/smads信号通路指标(TGF-β1、TβRⅠ、smad2、smad3)及TR4的mRNA和蛋白表达水平。 结果: 1、蛋白免疫印迹结果显示,与假手术组相比,BDL大鼠模型组肝组织TR4蛋白表达显著增加(P<0.01);免疫组化结果显示,假手术组TR4阳性染色见于少量肝细胞的细胞核;BDL模型组TR4蛋白大量表达,阳性染色主要位于新生胆管上皮细胞核及新生胆管周边的肝细胞及肌成纤维细胞的细胞核。 2、MOI=50条件下,shTR4慢病毒转染JS1细胞,并予嘌呤霉素筛选后,绿色荧光观察显示,慢病毒转染效率达90%以上。PCR筛选出效果最好的一组shTR4慢病毒,TR4 mRNA表达较阴性对照组下降了79.2%(P<0.01),shTR4蛋白表达下降了50%(P<0.01)。JS1细胞TR4基因干扰后,与阴性对照组相比:细胞增殖率显著降低(P<0.01);α-SMA、ColⅠ mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.01);TGF-β1、TβRⅠ、smad2、smad3mRNA表达显著降低(P<0.01),TGF-β1、p-TβRⅠ、p-smad2/3蛋白表达显著降低(P<0.01); RXRα mRNA和蛋白表达显著增加(P<0.01);smad7、RARβ mRNA表达无显著变化(p>0.05),TβRⅠ、smad2/3、smad7、RARβ蛋白表达无显著变化(p>0.05)。 3、MOI=100条件下,TR4过表达慢病毒转染JS1细胞,并予嘌呤霉素筛选后,绿色荧光观察显示,慢病毒转染效率达90%以上,OE TR4组TR4 mRNA和蛋白表达较阴性对照组显著升高(P<0.01)。JS1细胞TR4基因过表达后,与阴性对照组相比:细胞增殖率显著升高(P<0.01);α-SMA、ColⅠ mRNA和蛋白表达显著增加(P<0.01); TGF-β1、TβRⅠ、smad2、smad3 mRNA表达显著增加(P<0.01),p-TβRⅠ、p-smad2/3蛋白表达显著增加(p<0.01); RXRαmRNA和蛋白表达显著降低(P<0.01);smad7、RARβ mRNA表达无显著变化(P>0.05),TGF-β1、TβRⅠ、smad2/3、smad7、RARβ蛋白表达无显著变化(P>0.05)。 4、在正常JS1细胞,与control组相比:AST(20ug/ml)、GA(50uM)分别单用及二者联用显著降低JS1细胞增殖率(P<0.01),且二者联用显著低于二者分别单用(P<0.01); AST单用及与GA联用显著降低α-SMA、ColⅠ mRNA和蛋白表达(P<0.01),且二者联用显著低于二者分别单用(P<0.01或P<0.05);根据金氏公式计算Q值>1.15,提示AST、GA联用在抑制JS1细胞增殖及降低α-SMA、ColⅠ mRNA和蛋白表达方面具有协同作用;AST单用及与GA联用TGF-β1、smad2、smad3 mRNA表达显著降低(P<0.01或P<0.05),GA单用smad2 mRNA表达显著降低(P<0.01),二者联用TGF-β1、smad3mRNA表达显著低于二者分别单用(P<0.01),AST单用及与GA联用TGF-β1、p-TβRⅠ、smad2、smad3、p-smad2/3蛋白表达显著降低(p<0.01),GA单用smad2、p-smad2/3蛋白表达显著降低(P<0.01),二者联用TGF-β1、p-TβRⅠ、p-smad2/3蛋白表达显著低于二者分别单用(P<0.05或P<0.01);AST、GA二者分别单用和联用TR4mRNA和蛋白表达均显著降低(p<0.01),且二者联用TR4mRNA表达显著低于二者分别单用(P<0.05或P<0.01)。 5、在TR4过表达的JS1细胞(TR4-JS1),和过表达对照组(TR4组)相比:AST(20ug/ml)、GA(50uM)分别单用和二者联用在mRNA和蛋白水平均显著降低TR4表达(P<0.01);AST、GA分别单用及二者联用在mRNA和蛋白水平均显著降低α-SMA、ColⅠ表达(P<0.01),且二者联用显著低于二者分别单用(P<0.01);AST单用及与GA联用显著降低TβRⅠ、smad2、smad3 mRNA表达(P<0.01或P<0.05),GA50uM单用smad2 mRNA表达显著降低(P<0.05), AST、GA分别单用和二者联用显著降低p-TβRⅠ、p-smad2/3蛋白表达(P<0.01),且二者联用显著低于二者分别单用(P<0.01或P<0.05);与TR4组相比,AST、GA分别单用及二者联用TGF-β1 mRNA和蛋白表达均无统计学差异(P>0.05)。 结论: 1、TR4促进肝星状细胞的活化,其机制与提高p-TβRⅠ、p-smad2/3蛋白表达及降低RXRα受体水平有关。 2、AST、GA配伍抑制肝星状细胞增殖和活化具有协同作用,其机制与调控TR4→p-TβRⅠ→p-smad2/3信号通路有关。