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Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒（DHAV-3）是近年来引起我国雏鸭病毒性肝炎的主要病原之一,具有高度传染性和致死性。本研究利用昆虫杆状病毒表达系统表达DHAV-3主要保护性抗原基因,并对表达的重组蛋白进行了免疫原性初步研究,同时建立了可用于检测雏鸭血清样品中DHAV-3抗体的间接ELISA方法,具体研究内容如下:1.构建原核表达载体pCold-VP0,经IPTG诱导表达于上清,SDS-PAGE和Western blot分析鉴定,结果表明获得的重组VP0蛋白能与HIS抗体和DHAV-3多抗血清发生特异性反应。以纯化后的重组VP0蛋白作为包被抗原,对包被浓度、封闭条件、等进行优化,结果显示,VP0-ELISA的最佳抗原包被浓度为4μg/mL,待检血清最佳稀释度为1:200,酶标抗体最佳工作浓度为1:5 000。确定阳性判定值为0.336。批内和批间系数均小于5%,表明该方法具有较好的重复性。VP0-ELISA检测方法与STN检测方法相比,阳性符合率为80%,阴性符合率100%,总符合率为94%。2.通过RT-PCR扩增出P1和3CD基因片段,并分别插入同一p Fast Bac-Dual供体质粒的PPH和PP10启动子下,将鉴定正确的重组质粒转座DH10Bac,经蓝白斑筛选,挑取白色阳性克隆菌,提取重组Bacmid。重组Bacmid转染至Sf9细胞,分别获得重组杆状病毒rDHAV3。在sf9细胞中传代至P3代,测得P3代r DHAV3的感染滴度为1.0×1011PFU/mL。Western blot和IFA结果显示,P1前体蛋白成功的被3CD蛋白酶切割为VP0、VP1、VP3三种结构蛋白,且具有良好反应原性。电镜下重组杆状病毒自我装配成直径约25 nm的病毒样颗粒（VLP）。3.将上述P3代rDHAV3的细胞感染上清作为抗原免疫SPF雏鸭,检测其免疫原性。试验组为免疫水佐剂的rDHAV3 VLP,对照组为免疫野生型Bacmid和PBS。免疫前后雏鸭颈静脉采血,检测DHAV-3特异性抗体。分离的外周血则进行淋巴细胞增殖试验。免疫1周后使用HBGT株进行攻毒保护试验,每只0.2 m L 1000*LD50(LD50为10-6.6/0.2 mL)。结果显示,试验组雏鸭免疫1周后OD450nm值为0.412（>0.336）,说明雏鸭体内开始产生特异性抗体,与对照组雏鸭差异显著（P<0.05）;淋巴细胞增殖试验发现试验组淋巴细胞SI值为2.1,较对照组差异显著（P<0.05）。攻毒保护试验结果表明,试验组雏鸭的保护率为80%。综上所述,本研究构建表达了DHAV-3的P1和3CD蛋白,形成的r DHAV3 VLP可以诱导雏鸭产生体液免疫和细胞免疫,并能在一定程度上保护雏鸭抵御病毒攻击。研究结果为DHAV-3感染防控及其基因工程疫苗的研究提供参考。