布洛芬是2-芳基丙酸类的一种重要药物,具有很好的抗炎、镇痛、解热等作用,是世界卫生组织和美国FDA唯一共同推荐的儿童退烧药。布洛芬在其α-碳上存在一个手性中心,因此其具有两种光学对映异构体,且二者间差异很大,S-布洛芬的药理活性是R-型的160倍,且药物所产生的副作用几乎均是由R-型异构体引起的。由于布洛芬不同对映体之间的药理活性存在巨大差异,因此对布洛芬进行手性拆分,得到较高纯度的S-型异构体有重要的医学意义,以单一对映体供药不但可减少药剂用量,而且能降低药物的毒副作用。实现手性药物拆分的方法较多,如常用的有晶种结晶、化学拆分、膜拆分,色谱拆分和酶法拆分等。但与其他拆分方法相比,运用脂肪酶进行手性拆分其反应条件温和、对映体选择性高、对环境友好,因此成为制备现代手性药物新技术的研究热点。本文以皱褶假丝酵母脂肪酶(Candida rugosa lipase,CRL)为催化剂,用于催化酯化拆分外消旋布洛芬,并利用溶剂工程、反胶束体系和酶固定化等新技术,以提高CRL的拆分效率,获得高纯度对映体。主要研究工作和结果摘要如下:(1)优化游离酶在非水相体系中对外消旋布洛芬的酯化拆分工艺,分析游离酶在不同溶剂中的催化机理。以异辛醇为羟基供体,底物摩尔比为异辛醇:布洛芬=6:1,体系含水量≤2%,反应温度为50°C时,游离酶CRL的催化效率最高。通过工艺优化,脂肪酶用量73,900 U,转化率达40%时,反应时间可由48h缩短至12h,大幅度提高了催化效率。在选择的13种有机溶剂和3种离子液体中,脂肪酶在异辛烷非水相体系中的催化效率最高,在[Emim]PF6中次之。对不同溶剂处理后的CRL的红外光谱数据进行拟合计算,发现在log P值较高的极性溶剂中,脂肪酶催化拆分外消旋布洛芬的转化率和ees值一般均较大,酶分子二级结构α-螺旋适量降低,这有助于脂肪酶活性中心“盖子”结构打开,又能保持相对稳定的二级构象,从而使酶保持良好的催化活性。(2)优化脂肪酶在反胶束体系中催化拆分外消旋布洛芬的工艺参数。对反胶束体系中crl对外消旋布洛芬的酯化拆分进行了单因素条件优化,并在单因素结果基础上,选择反应温度、含水量ω0和tritonx-100添加量进行了3因素3水平的响应面优化,用sas9.0软件分析获得的脂肪酶催化拆分外消旋布洛芬最优条件为:反应温度46.77°c,含水量ω02.17,tritonx-100含量14.26%,该条件下预测的最高转化率为39.03%。运用此条件进行实验验证,得到的转化率为38.83%,ees为65.45%,与模拟值接近。而在相同实验条件下,异辛烷中的转化率仅为13.93%,ees为20.31%,证明反胶束体系可有效提高酶对外消旋布洛芬的拆分效率。(3)系统优化了三种无载体固定化酶pcmcs、cl-pcmcs、cleas的制备工艺。对于pcmcs,在以丙酮为沉淀溶剂,饱和硫酸钾:酶液=5:1,缓冲溶液ph为9.0,体系含水量为20%的实验条件下,所制备的crl-pcmcs催化活力最大,其转化率高达49.18%,ees值为97.74%。对于cl-pcmcs,在150μl25%的戊二醛交联60min的条件下,所制备的crl-cl-pcmcs效果较理想,其转化率可达46.78%,ees值达88.98%。而对于cleas,在系统含水量为6%,以80mg葡萄糖作为稳定蛋白的添加剂,戊二醛添加量为200μl的条件下,制备得到的cleas催化效果最好,其转化率可达40.41%,ees值为62.34%。(4)比较了三种无载体固定化脂肪酶pcmcs、cl-pcmcs、cleas的物理形态、酶学性质和催化拆分外消旋布洛芬的效果。研究表明不同方式制备的固定化酶晶体形状各不相同,与游离酶的松散结构相比,固定化酶均呈连接聚集状态,其中pcmcs、cl-pcmcs可观察到明显的晶核结构,脂肪酶附着其上。在各自的最优条件下制备得到的三种固定化酶的最适反应温度均为50°c,在此温度下的催化能力为:pcmcs>cl-pcmcs>cleas>游离酶。与游离酶相比,固定化酶温度稳定性得到较大提高,在70°c下处理3h后,游离酶的催化转化率仅为对照组的25.68%,而crl-cleas,crl-pcmcs和crl-cl-pcmcs的催化转化率分别可保持对照组的75.98%、72.79%和57.71%。经不同疏水性溶剂处理后,固定化酶能保持较高的酶学活性,具有较好的有机试剂耐受性。三种固定化酶在重复操作性能上均有不错的表现,重复操作15批次后,pcmcs,cl-pcmcs,cleas的相对酶活力仍能保持83.04%、89.56%、70.38%。