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小反刍兽疫(Peste des petits ruminants,PPR)是由副粘病毒科麻疹病毒属的小反刍兽疫病毒(Pest des petits ruminants virus,PPRV)引起的一种急性、高度接触性烈性传染病,主要感染山羊和绵羊等小反刍动物。PPR自1942年在非洲被发现以来,不断向全球蔓延。2007年7月,我国首次在西藏爆发PPR疫情,2013年至2014年全国19个省区再次爆发PPR疫情,对我国养殖业造成巨大经济损失。2015年4月,在科特迪瓦首都阿比让举行的动物卫生专家会议一致同意,尝试在全球消除小反刍兽疫病毒。因此,尽快开展小反刍兽疫的病原学、流行病学、诊断与预防控制技术的综合性研究,建立快速敏感的诊断方法对PPR的防控具有深远的社会和经济意义。目前针对PPRV的诊断方法较多,其中血清学检测方法主要是病毒中和试验(virus neutralization test,VNT)和竞争ELISA方法,但前者存在操作周期长,因操作活病毒而设施要求高等缺点;后者存在价格较贵、制备复杂等缺点。免疫过氧化酶单层试验(immunoperoxidase monolayer assay,IPMA)具有快速、敏感、特异、操作简单的特点,已应用于多种病原的血清临床样本检测。但国内外还没有建立针对PPRV的IPMA检测方法,因此建立PPRV-IPMA检测方法对于PPR疫情的监测和防控具有一定的重要意义。为建立针对PPR的IPMA检测方法,本研究首先建立了稳定表达山羊SLAM的BHK-21细胞系(BHK-gSLAM)。rPPRV/GFP感染该细胞系后,能复制增殖且形成明显的合胞体,而在亲本细胞上无该现象。Western blot试验表明该细胞系能稳定表达SLAM蛋白至少20代。在细胞系建立的基础上,通过感染rPPRV/GFP制备抗原检测板,建立了IPMA检测方法,具体步骤如下:首先比较了Vero细胞和BHK-gSLAM两者在IPMA试验中的差别,结果表明,在IPMA反应板制备过程中,同等剂量的rPPRV/GFP感染Vero和BHK-gSLAM细胞,后者病变形成时间更早,并形成易于观察的合胞体;BHK-gSLAM细胞生长更紧密,形成的CPE更明显,其在AEC染色后更易于观察,因此最终选择该细胞系用于IPMA抗原检测板的制备。其次,本研究优化并确定了IPMA的最佳接毒剂量为104 TCID50/mL,病毒感染72 h后固定制备IPMA反应板,血清最佳起始稀释度为1:10,二抗最佳工作浓度为1:5000。最后,用该IPMA检测方法对198份羊血清(包括临床样本和PPR弱毒疫苗免疫后样本)进行检测,同时以VNT方法作为对照,结果表明,两者的符合率为95.5%。与VNT相比,IPMA的相对敏感性为91%,特异性为100%。综上所述,本研究建立的IPMA方法操作简单,易于观察,检测时间仅为3小时,检测结果与VNT方法符合率较高,同时具有良好的特异性和敏感性,可以替代VNT用于PPRV免疫效果的评价和流行病学调查。