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间变性大细胞淋巴瘤(anaplastic large-cell lymphoma, ALCL)是一类具有强攻击性的恶性血液肿瘤。研究发现,患者在二号染色体上的间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)基因和五号染色体上核磷蛋白(NPM)基因参与染色体的置换,形成同源二聚体NPM-ALK,导致ALK激酶的持续性激活,是该类疾病的重要病因。NPM-ALK与-些重要的下游靶蛋白通过几个关键酪氨酸残基结合发挥相互作用,其效应涉及细胞的生存、增殖等一系列重要的生命活动。这预示NPM-ALK的关键酪氨酸位点是治疗该疾病的理想靶点,其中644、664酪氨酸残基磷酸化位点的细胞分子调控机制尚不清楚。本论文通过定点突变与质粒重组,构建野生型质粒pEGFP-N1NPM-ALK、双点突变型质粒pEGFP-N1NPM-ALKY644、664F。将其瞬时转染到人胚肾细胞293T中,荧光观察、RT-PCR和Western Blot检测GFP和NPM-ALK融合蛋白表达；并在此基础上检测到在人胚肾细胞293T中,NPM-ALKY644、664F的质粒下游信号分子的磷酸化水平显著降低。将重组质粒转染到T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat中,成功建立稳定表达NPM-ALK淋巴细胞白血病的细胞系,并对其功能进行初探。Western Blot检测NPM-ALKY644、664F的质粒下游信号分子的磷酸化水平显著降低,这与在293T细胞中得到了一致的结论。同时,IP检测到双点突变的NPM-ALK会降低IGF-1R的磷酸化作用。CCK-8及软琼脂克隆形成实验结果显示与野生型NPM-ALK相比,NPM-ALKY644、664F将明显降低NPM-ALK的致癌性。通过流式细胞术,我们检测到在稳定细胞系中, NPM-ALK使得Jurkat细胞产生了G1期阻滞,而NPM-ALKY644、664F会很大程度上缓解这一阻滞作用。进而我们通过Western Blot检测到几种周期相关蛋白表达的变化,这与上述现象是一致的。由此可见,644和664酪氨酸磷酸化位点对于NPM-ALK发挥其生物学功能至关重要。前期对一种由香椿和麝香配比而成的中药混合制剂的抗肿瘤研究中发现,它对多种癌细胞有不同程度的生长抑制作用,我们检测了该制剂对已构建的稳定细胞系的杀伤力,显示此药物对表达NPM-ALK的稳定细胞系杀伤力明显大于表达NPM-ALKY644、664F的稳定细胞系。结果提示NPM-ALK蛋白的644、664两个酪氨酸磷酸化位点可能会成为作为这类疾病治疗的药物靶点。综上所述,我们认为NPM-ALKY644、664F由于关键磷酸化位点的突变,使得NPM-ALK与IGF-1R的结合作用明显减弱,也使得NPM-ALK对下游信号分子的磷酸化作用下降,很大程度上减弱了NPM-ALK的致癌性。也正是由于这两个位点的突变使得NPM-ALK对药物产生了不同的反应,为后期将上述位点作为药物筛选的靶点奠定了基础。