一、目的：　　 胚胎植入是十分复杂的过程，需要子宫内膜与胚胎在时间和空间上的同步协调。一方面，胚胎发育至胚泡阶段;另一方面，子宫内膜发育到允许胚胎侵入的接受态。在着床窗口期，子宫内膜经历一系列的形态学和生化改变，有利于胚胎植入。细胞表面糖蛋白介导细胞与细胞之间，细胞与细胞外基质之间的黏附。CD82糖蛋白属于跨膜四糖蛋白，可以抑制细胞的转移和迁移。研究表明:人类母胎界面的蜕膜细胞大量表达CD82蛋白，提示CD82可能参与胚胎植入。　　 子宫内膜的周期性变化受到卵巢激素的调控。在这些激素中，孕激素对于人类妊娠的的建立和维持起到决定性的作用。同时，接受态的子宫内膜与胚胎之间的黏附也受到孕激素的调控。孕激素受体是很多避孕药的靶位点。米非司酮(RU486)是一种孕激素受体的拮抗剂，被认为是一种常用的避孕药物。RU486的避孕机制甚多，但是其与着床窗口期的标志性分子岩藻糖基转移酶Ⅳ(FUT4)之间的关系尚无报道。　　 子宫内膜从非接受态向接受态转变的过程中，许多特异性的分子及其在子宫内膜表面的受体或者配体出现时空特异性的表达，有利于胚胎着床。S100A10及其配体AnnexinA2形成异四聚体移位到细胞膜上，发挥多种生物学作用。研究发现，S100A10在早期妊娠的小鼠及恒河猴的植入位点显著上调。而AnnexinA2蛋白在妊娠期的母胎界面持续增高。提示我们S100A10/AnnexinA2可能参与胚胎植入。　　 本文通过对CD82，S100A10以及AnnexinA2四个着床相关分子在人类月经周期不同阶段的表达和调控的研究，进一步探讨它们在生殖过程中的功能和作用机制，为阐明它们在生殖中的作用提供理论依据。同时，对生殖疾病的治疗以及辅助生殖中妊娠成功率的提高具有一定的意义。　　 二、方法：　　 1.采用免疫组织化学检测CD82，S100A10，AnnexinA2蛋白的表达及定位。　　 2.利用脂质体转染法将重组的CD82过表达质粒或CD82干扰质粒(CD82-siRNA)转染至人子宫内膜细胞系(RL95-2/HEC-1A)中。其中，RL95-2细胞系和HEC-1A细胞系分别代表高/低接受态的子宫内膜上皮细胞。　　 3.采用RT-PCR方法检测CD82，FUT4基因表达。　　 4.采用real-timePCR方法检测S100A10，AnnexinA2基因表达。　　 5.采用Westernblot检测CD82，FUT4，S100A10，AnnexinA2蛋白表达。　　 6.采用间接免疫荧光方法检测CD82的表达。　　 7.利用黏附实验观察和分析胚胎细胞与子宫内膜细胞之间的黏附情况。　　 三、结果：　　 （一）CD82在月经周期及不同接受态子宫内膜细胞中的差异性表达分析　　 1.通过免疫组化方法检测到CD82在着床窗口期的人类子宫内膜中的表达出现峰值。　　 2.应用RT-PCR、Westernblot和间接免疫荧光方法检测到RL95-2细胞CD82的表达高于HEC-1A细胞。　　 3.应用RT-PCR和Westernblot发现孕激素可以刺激CD82在RL95-2细胞和HEC-1A细胞中的表达。　　 4.CD82干扰质粒抑制胚胎细胞与RL95-2细胞的黏附率;CD82过表达质粒促进胚胎细胞与HEC-1A细胞的黏附率;CD82抗体封闭RL95-2或者HEC-1A细胞，可抑制胚胎细胞与子宫内膜细胞的黏附率。　　 5.CD82干扰质粒可以抑制RL95-2细胞中FAK信号通路的激活，CD82过表达质粒可以激活HEC-1A细胞中FAK信号通路。　　 （二）米非司酮(RU486)通过调节CD82抑制岩藻糖基转移酶Ⅳ的表达抑制胚胎体外黏附　　 1.RU486抑制JAR细胞与RL95-2单层之间的黏附。　　 2.采用RT-PCR筛选RL95-2细胞中的FUT家族基因，发现RU486对于FUT4基因表达的抑制最为明显。　　 3.应用RT-PCR和Westernblot检测到RU486抑制RL95-2细胞以及流产妇女子宫内膜中FUT4的表达。　　 4.RU486抑制RL95-2细胞中CD82的基因以及蛋白表达。　　 5.CD82干扰质粒抑制RL95-2细胞中FUT4的表达，CD82过表达质粒促进RL95-2细胞中FUT4的表达。　　 6.RU486通过RU486/CD82/FUT4信号通路抑制胚胎与子宫内膜细胞的黏附。　　 （三）S100A10及其配体AnnexinA2在人类月经周期子宫内膜中的表达变化　　 1.通过免疫组化和Westernblot检测到S100A10和AnnexinA2蛋白均在着床窗口期的人类子宫内膜中出现表达峰值。主要定位于腔上皮和腺上皮的胞浆、胞膜上。　　 2.应用real-timePCR检测到S100A10和AnnexinA2的mRNA均在着床窗口期的人类子宫内膜中出现表达峰值。　　 四、结论：　　 （一）CD82在月经周期及不同接受态子宫内膜细胞中的差异性表达分析　　 1.CD82在着床窗口期的人类子宫内膜中的表达呈现峰值。同时，CD82在高接受态的子宫内膜细胞系RL95-2中表达高于其在低接受态子宫内膜细胞系HEC-1A中。提示CD82可以作为子宫内膜接受态的标志物。　　 2.孕激素可以刺激CD82的表达。上调或抑制细胞中CD82表达，可以影响胚胎与子宫内膜的黏附率。说明CD82在胚胎植入的过程中发挥作用。　　 3.CD82通过调节RL95-2以及HEC-1A细胞中FAK信号通路的激活，参与胚胎植入。　　 （二）米非司酮(RU486)通过调节CD82抑制岩藻糖基转移酶Ⅳ的表达抑制胚胎体外黏附　　 1.RU486能够明显抑制RL95-2细胞中FUT4的表达。而且，服用RU486流产妇女的子宫内膜中FUT4的表达较物理性流产的妇女更低。表明FUT4受孕激素受体的调控，从而在胚胎植入过程中发挥作用。　　 2.上调或抑制RL95-2细胞中CD82的表达，可以调节RL95-2细胞中FUT4的合成水平，进而影响胚胎与子宫内膜的黏附率。结果表明CD82介导FUT4在胚胎植入过程中的作用。　　 3.RU486抑制CD82的表达，RU486通过RU486/CD82/FUT4信号通路抑制胚胎与子宫内膜的黏附。　　 （三）S100A10及其配体AnnexinA2在人类月经周期子宫内膜中的表达变化　　 1.S100A10蛋白及mRNA在增生期和分泌期的子宫内膜中持续表达，分泌期的表达明显高于增生期。其表达峰出现在着床窗口期。说明CD82在胚胎植入的过程中发挥作用，可以作为子宫内膜接受态的标志物。　　 2.AnnexinA2蛋白及mRNA在增生期不表达，在分泌中晚期的表达较高，与着床窗口期相一致。提示AnnexinA2可能是子宫内膜接受态的建立所必须的，可以成为评价内膜接受性的标志物。