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鹿茸是雄鹿未骨化密生茸毛的幼角,主要含有氨基酸、总磷脂、脂肪酸、糖类、激素样物质、硫酸软骨素、多胺、肽类、维生素、酶类以及碱基类物质等,其中氨基酸成分占总成分的一半以上。鹿茸中的蛋白质主要是以角蛋白、胶原蛋白、胰岛素样生长因子和表皮成长因子等形式存在,具有提高机体的免疫功能和抗氧化能力,能够促进组织创伤的愈合,降血糖等生理作用。为了研究鹿茸多肽的降血糖活性及构效关系,为鹿茸生物活性肽的开发和利用创造条件,本文以马鹿茸为原料,确定马鹿茸降血糖肽的制备工艺条件、对马鹿茸降血糖肽进行分离纯化、对分离组分进行体外降血糖效果验证并对多肽的结构进行分析。具体研究内容和实验结果如下:(1)马鹿茸降血糖肽制备研究:采用双酶法以马鹿茸为原料制备降血糖肽。从Alcalase、Flavourzyme、中性蛋白酶和胰蛋白酶四种酶中筛选出其酶解产物对α-葡萄糖苷酶抑制率高的两种酶,分别为Alcalase和Flavourzyme,并根据其体外降血糖效果确定酶的作用顺序为Alcalase-Flavourzyme,通过单因素实验和正交实验确定双酶酶解适宜工艺条件为先用Alcalase在pH8.0,60℃,底物浓度为12%,加酶量为5000 U/g条件下酶解3h,再用Flavourzyme于pH6.5,45℃,底物浓度为5%,加酶量为6000 U/g条件下酶解1 h。双酶分步水解终产物的α-葡萄糖苷酶抑制率受质量浓度的影响,当质量浓度为3 mg/mL时,α-葡萄糖苷酶抑制率可达94.09%,IC50值为1.82 mg/mL。(2)马鹿茸降血糖肽分离纯化研究:采用超滤技术对马鹿茸降血糖肽进行富集,将收集的小分子多肽通过Sephadex LH-20葡聚糖凝胶色谱进行分离纯化,在加样量1.5mL、加样浓度55 mg/mL、洗脱流速0.25mL/min的条件下,马鹿茸降血糖肽可分离得到四个组分,分别为PⅠ、PⅡ、PⅢ、PⅣ。(3)马鹿茸降血糖肽体外降血糖功能研究:建立HepG2细胞胰岛素抵抗模型,确定最适胰岛素浓度为10-7mmol/L;研究马鹿茸降血糖肽纯化组分对HepG2细胞的影响,其中组分PⅢ(0.05mg/mL)的葡萄糖消耗量最高,其对细胞存活率的影响高于阳性对照;为了更全面的研究马鹿茸降血糖肽纯化组分的体外降血糖功能,选取大鼠胰岛β细胞株RIN-m5F来验证体外降血糖功能,高剂量的组分PⅢ对细胞的增殖作用接近于阳性对照(Exendin-4),其对经STZ(链脲佐菌素)损伤的胰岛β细胞的细胞增殖率高于其他组分(PⅠ、PⅡ、PⅣ),接近于阳性对照组的效果。(4)马鹿茸降血糖肽分子量测定及氨基酸序列分析:将超滤后的马鹿茸降血糖肽通过Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳法分析,结果发现有4条清晰的条带,分子量分布在3.3kDa～7.8kDa之间。利用纳升级液相色谱(nano-HPLC-MS/MS)分析出马鹿茸降血糖肽纯化组分PⅢ中共有多肽308条,其中置信度大于90%的多肽有15条,分子量分布在 420.46Da 至 749.4Da 之间。