论文部分内容阅读
星形胶质细胞是中枢神经系统（central nervous system,CNS）最丰富的胶质细胞类型,参与CNS多种生理或病理过程。CNS损伤后星形胶质细胞会发生反应性增生,在损伤区形成胶质瘢痕,保护周围组织免受损伤的扩散,同时也会合成和分泌多种神经营养因子,其中包括神经生长因子（nerve growth factor,NGF）。NGF是目前为止研究较为透彻的一类神经营养因子,以往的研究多集中于其对神经元的保护作用。而近期有研究表明NGF能通过p75神经营养因子受体(p75 neurotrophine receptor,p75NTR)减弱星形胶质细胞的增殖从而控制胶质瘢痕的大小。根据Raff的胶质细胞双谱系学说,可以将星形胶质细胞分为1型星形胶质细胞（type 1 astrocytes,T1As）和2型星形胶质细胞（type 2 astrocytes,T2As）。T2As来源于O2A谱系的O2A祖细胞（oligodendrocyte-type 2 astrocyte progenitor cells/oligodendrocyte precursor cells,OPCs）我们前期的研究显示,T2As可去分化为神经干细胞样细胞（neural stem-like cells,NSLCs）,NSLCs在条件培养基中可进一步被诱导分化,形成神经干样细胞诱导分化细胞（neural stem-like cell differentiated cells,NSLDCs）。因此,本实验初步研究NGF信号对星形胶质细胞分化的影响。目的:体外培养两型星形胶质细胞,研究NGF作用后两型星形胶质细胞的形态学以及蛋白表达的变化,探讨其对不同谱系来源星形胶质细胞的生长是否有影响;培养OPCs、T2As、NSLCs及NSLDCs,研究NGF信号对O2A谱系星形胶质细胞分化的影响。方法:实验动物采用SD新生（P1）大鼠,分离纯化两型星形胶质细胞,分别设NGF（100 ng/ml）处理组和无NGF对照组。72 h后,观察各组细胞形态,应用Western blot检测NGF受体p75NTR,胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）和成束和延伸蛋白1（fasciculation and elongation protein zeta-1,FEZ1）表达变化;体外培养OPCs、T2As、NSLCs及NSLDCs,分别设NGF（100 ng/ml）作用组和无NGF对照组,72 h后观察各细胞形态,Western blot检测各细胞NGF低亲和力受体p75NTR和高亲和力受体酪氨酸激酶受体A（Tropomyosin receptor kinase A,TrkA）表达以及NGF-TrkA下游通路蛋白激酶B（protein kinase B,PKB又称Akt）和细胞外调节蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinase 1/2,Erk1/2）磷酸化水平;应用免疫荧光和Western blot检测NGF作用NSLCs 3 d后,NSLDCs的乙酰胆碱转移酶（choline acetyl transferase,ChAT）、FEZ1及生长相关蛋白（growth associated protein 43,GAP43）的表达。结果:（1）NGF作用后,T1As数量较少,胞体变小,突起减少,p75NTR表达上调,GFAP及FEZ1表达下调;T2As突起增多增长,FEZ1表达上调,p75NTR和GFAP表达无显著变化。（2）T2As去分化为NSLCs后,开始表达TrkA,NGF作用后,NSLCs分化形成的NSLDCs TrkA表达显著上调,Akt和Erk1/2磷酸化水平升高。（4）NGF作用后能使NSLDCs的ChAT阳性率及表达量提高。（5）NGF作用的NSLDCs呈GAP43及FEZ1阳性。结论:（1）NGF可能结合p75NTR,抑制T1As生长。（2）T2As去分化为NSLCs后能表达TrkA,NGF与TrkA结合,激活NGF-TrkA通路,使Akt和Erk1/2磷酸化水平增高,促进NSLCs向胆碱能神经元定向分化,表达GAP43及FEZ1,具有神经再生和修复能力。