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研究目的:(1)合成柴胡皂苷c(SSc)的人工抗原,制备柴胡皂苷c单克隆抗体。(2)在柴胡皂苷c抗体的基础上建立相应的免疫分析方法,并对该方法进行方法学考察。(3)应用建立的免疫分析方法,检测中药复方中柴胡皂苷c含量,为中药复方研究提供新的技术手段。研究方法:(1)采用高碘酸钠法制备柴胡皂苷c的包被原(SSc-OVA)和免疫原(SSc-BSA)。利用紫外光谱法和MALDI-TOF-MS法对SSc-BSA进行鉴定。(2)采用背部皮下散点注射的方式对6周龄雌性BALB/c小鼠进行免疫,4次免疫后采用ELSIA法检测血清中抗体的效价及灵敏度。挑选封闭液并筛选包被原工作浓度。采用聚乙二醇(PEG)法融合SP2/0细胞与免疫鼠脾细胞,采用有限稀释法筛选阳性单克隆细胞株。(3)诱导腹水法进行抗体的扩大化生产,并采用辛酸-硫酸铵法进行抗体纯化。(4)基于SSc的单克隆抗体建立了针对SSc的竞争性ELISA方法,并进行了特异性、灵敏度、稳定性、回收率等方法学考察。(5)应用SSc的免疫分析法检测中药饮片配制的中药复方中柴胡皂苷c的含量及中药颗粒配制同种复方中柴胡皂苷c的含量。研究结果:(1)本研究制备了柴胡皂苷c的人工抗原,采用紫外扫描法和MALDI-TOF-MS对SSc-BSA进行鉴定,SSc-BSA偶联成功且偶联比为17。(2)筛选SSc-OVA的工作浓度为1:4000,封闭液为5%的脱脂奶粉。SSc-BSA诱导小鼠产生抗SSc血清抗体效价达1:16000以上。(3)挑选阳性竞争均较好的杂交细胞进行单克隆化,多次进行传代、冻存及复苏成功获得性质稳定的单克隆细胞株。成功诱导小鼠生产腹水并进行纯化。ELSIA方法检测结果显示,纯化前后抗体效价变化不大。(4)本实验在SSc抗体的基础上成功建立了 SSc的酶联免疫分析方法。筛选包被原及抗体工作浓度,确定SSc-OVA以1:10000包被,纯化后抗体稀释2000倍作为工作液浓度。建立了 SSc的竞争抑制曲线,方程为:y=-0.2831n(x)+2.3301,R2=0.9909,线性范围为156.25-2500ng/mL,灵敏度为625 ng/mL,批内变异系数<7.5%,批间变异系数<10%,平均回收率为101.7%,且该ELSIA法且与HPLC相关性较好。(5)本实验利用SSc的免疫分析法检测了中药材和中药颗粒分别配制的大柴胡汤、小柴胡汤等五种中药复方中SSc的含量。中药材配制的柴胡桂枝汤、大柴胡汤、小柴胡汤、补中益气汤中柴胡皂苷c含量分别为21.91mg/g、16.17mg/g、20.45mg/g、15.06mg/g。中药颗粒配制的柴胡桂枝汤、大柴胡汤、小柴胡汤、补中益气汤中柴胡皂苷c含量分别为18.46mg/g、13.41mg/g、17.70mg/g、18.46mg/g。甘草泻心汤中不含柴胡,故中药材和中药颗粒配制的该复方中均未检测到柴胡皂苷c,从侧面验证该ELISA法的特异性。结论:本实验采用高碘酸钠氧化法首次合成了柴胡皂苷c人工抗原,并首次成功制备了柴胡皂苷c的单克隆抗体。基于制备的抗柴胡皂苷c单克隆抗体,建立了柴胡皂苷c的酶联免疫吸附法。该方法经过方法考察具有稳定性好、回收率高等特点,可用于柴胡皂苷c的含量测定。该方法已初步应用于中药复方成分的检测。