硫化氢(H2S)、半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)是重要的生物巯基化合物,这些生物分子可以维持细胞内的氧化还原动态平衡,参与多种生理病理过程,其代谢水平异常与多种疾病密切相关,可以作为某些疾病的标志物,因此生物巯基化合物的区分检测及其生理功能的研究具有重要的生理学和医学意义。荧光探针方法可以原位、实时和可视化检测目标分析物,操作简便、生物相容性高。尽管已报道了许多荧光探针用于检测以上生物分子,但是用于特异性检测其中一种或两种,并研究其内在联系的荧光探针还鲜有报道。为此,利用巯基的强亲核性,本文以硝基苯并呋咱(NBD)-硫醚基/醚基/胺基为反应识别基团,开发了一系列区分检测生物巯基化合物的荧光分子探针。基于NBD硫醚基与巯基的快速硫解反应,本文首先设计合成了双颜色NBD-S-罗丹明荧光探针1,该探针与GSH/H2S反应后发出红色荧光,与Cys/Hcy反应后发出绿色和红色荧光,可以通过两种颜色通道特异性检测四种生物巯基化合物和Cys/Hcy。此外,探针1还具有高选择性和灵敏度,可以在毫摩尔级GSH存在条件下特异性检测人体活纤维肉瘤细胞中的 Cys/Hcy。为了同时区分和检测H2S和Cys/Hcy,本文利用H2S与NBD胺基以及Cys/Hcy与NBD-醚基的硫解反应,设计合成了双反应双淬灭荧光探针3。探针3可以分别在蓝色和绿色通道特异性、高灵敏地检测H2S和Cys/Hcy。探针3成功用于Cys诱导生成的内源性H2S的荧光成像,从而验证了 Cys经CBS酶催化生成内源性H2S的合成路径。因为与Hcy的结构相近,Cys的专一性检测一直颇具挑战。基于丙烯酸酯与生物巯基化合物的迈克尔加成反应以及NBD硫醚氨解反应,本文巧妙地设计合成动力学识别探针5。由于生物巯基化合物反应活性不同,该探针可以在30分钟内专一地检测活细胞中的Cys,又可以在3小时内特异性检测活细胞中的Hcy/GSH,从而通过一个探针就实现了对Cys和Hcy/GSH的同时、高选择性检测。综上所述,本文开发了一系列区分检测生物巯基化合物的荧光分子探针。其中,探针1可以分别在红色和绿色通道特异性检测四种生物巯基化合物和Cys/Hcy;探针3则可以分别在蓝色和绿色通道特异性检测H2S和Cys/Hcy;动力学识别探针5则可以在不同时间点特异性检测Cys和Hcy/GSH。本文的研究拓展了 NBD基荧光探针的开发与应用,为生物巯基化合物的检测与研究提供了一系列简便有效的荧光探针工具。