论文部分内容阅读
枣树是新疆阿克苏地区的重要经济林木果树,近些年,在该地区枣园中发现大量枣树表现类似病毒病的花叶和斑驳症状,为明确引起该病害的病原病毒种类,本研究采用小RNA(s RNA)和RNA深度测序技术与常规RT-PCR扩增技术相结合,从新疆阿克苏地区收集的发病枣树样品中鉴定到一种Emaravirus属病毒,即枣黄化斑驳相关病毒(jujube yellow mottle-associated virus,JYMa V),分析了该病毒的分子特性,并建立了该病毒的RT-PCR检测技术,研究结果对深入了解该病毒分子特性及枣病毒病防控具有指导意义。具体结果如下:1.采用s RNA测序及RT-PCR扩增产物测序获得了来源于一株灰枣的病毒分离物JYMa V-HZ基因组序列,包含6条负义单链RNA,RNA1-6大小分别7060nt、2221 nt、1228nt、1493 nt、1241 nt和941 nt,每条RNA的互补链包含一个开放阅读框(ORF)。与已报道的该病毒分离物JYMa V-SY编码蛋白相似性为91.2-97.3%。RNA-seq测序从样品AKS-6和AKS-15分别获得了该病毒的RNA 1-5及RNA1-6链近全长序列,这2个分离物基因组各ORF与JYMa V-HZ相应ORF的核苷酸和编码蛋白氨基酸序列相似性分别为90.2-99.3%和90.3-99.4%。2.根据JYMa V的RNA 3-6序列设计了3对特异性检测引物,从新疆阿克苏地区采集了86份枣树叶片和果实样品,其中61份有明显病毒病症状,从山西采集了10份无病毒病症状枣树叶片样品,采用RT-PCR技术检测JYMa V的结果显示,表现病毒病症状的样品的JYMa V检出率为91.8%,证实JYMa V侵染与枣花叶和斑驳病发生密切相关。3对引物均可用于该病毒检测,其中基于RNA5链设计引物检出率相对较高。3.选取JYMa V阳性的样品17个,采用基于该病毒基因组RNA链末端保守序列的引物3C/5H进行RT-PCR扩增和扩增产物的克隆及测序,获得了该病毒RNA 2-6序列各6、17、7、17和13条,同时扩增得到RNA1和RNA4的部分片段序列各21和17条。将这些序列与深度测序获得3个分离物序列及已报到的JYMa V-SY分离物序列进行比对,发现该病毒存在较大的分子变异,RNA2和RNA4的ORF大小与SY分离物不同;在RNA2-6的5’端非翻译区存在多位点的片段插入或缺失,3’非翻译区序列相对保守;不同分离物RNA1链的3’非翻译区出现重复片段。系统进化分析显示,JYMa V分离物形成不同的进化分支。4.对发病枣叶片和叶柄进行超薄切片,在透射电镜下观察到发病叶片的细胞质中有许多具双层膜结构的球状病毒粒子,大小在100-110 nm之间,而叶柄中很难观察到病毒粒子,表明JYMa V在寄主植物中非均匀分布。